optimalizované čistí inaktivovaná Zika vakcína poskytuje trvalé imunogenita a ochranu v cynomolgus macaques

ZPIV a ZPIV-SP formulace vakcíny

ZPIV kandidát (fáze I klinické dávky) byla poskytována WRAIR16. Vakcína byla dodána v kapalné formě připravené k injekci v 5 µg proteinů na dávku (500 µL), což odpovídá 200 antigenním jednotkám (AU), formulovaným s AlOOH. Optimalizovaná vakcína (ZPIV-SP) byla připravena v Sanofi Pasteur (Marcy l ‚ Etoile, Francie) za použití WRAIRSKÉHO procesu jako výchozího bodu s následujícími vylepšeními. Krátce, po počáteční amplifikaci ZIKV-PR v buňkách Sanofi Pasteur Vero byla virová RNA extrahována a transfektována do Vero buněk bez séra (SPSF) společnosti Sanofi Pasteur. Zotavil virus byl zesílen, plak-čistí dvakrát a dále zesílen pro generování pre-Master partie Osiva, z nichž hlavní a Pracovní partie Osiva byly odvozeny. Virus byl produkován v bioreaktoru o objemu 180 L pomocí buněk Spsf Vero. Virus byl poté vyčištěn, purifikován ultracentrifugací s modifikovaným mezním bodem a chromatografií a inaktivován formalinem. Parametry čisticích a inaktivačních kroků byly optimalizovány ve srovnání s podmínkami používanými WRAIREM. Léčivý přípravek byl upraven pro obsah antigenu obálky Zikv (E)pomocí ELISA na 400 AU / mL (což odpovídá 10 µg / mL proteinů ZPIV) a lyofilizován. Lyofilizované vakcíny byla nastavena na 100, 200 nebo 400 AU v jedné dávce (500 µL) a resuspendovány v AlOOH gel (500 µg/dávka—Brenntag Biosector, Dánsko). AU byl definován jako obsah antigenu obálky (Env) měřený pomocí ELISA.

Očkovacího kalendáře

Čtyři skupiny po šesti flavivirus-negativní samec makaka makaků (Macaca fascicularis – Noveprim), ve věku 2 let, obdržel 500 µL první generace ZPIV (skupina A: 200 AU) nebo optimalizované ZPIV-SP (skupina B: 100 AU, skupina C: 200 AU nebo skupina D: 400 AU) intramuskulárně (IM) v pravém čtyřhlavý sval v den 0 (D0) a v levém čtyřhlavý sval na D28. O šest měsíců později (D176), šest makaků ve skupině B, která získala 100 AU ZPIV-SP, obdržel booster dávku stejné formulace a byli sledováni po dobu 6 měsíců (Obr. 1). Ostatní skupiny byly použity pro virovou výzvu.

klinické monitorování

okamžité reakce byly pozorovány během 30 minut a potenciální lokální reakce v místě vpichu byly pozorovány po dobu 7 dnů po každé imunizaci. Makaky byly sledovány každý den a během studie byly zaznamenány příznaky, jako je snížený příjem potravy, omezená pohyblivost, polypnoe, lokální a systémové reakce. Tělesná hmotnost a tělesná teplota (pomocí transpondérových čipů) byly zaznamenány na začátku studie a v pravidelných intervalech v průběhu studie.

odběr Krve, post-očkování pro hodnocení imunogenicity

Sér byly odebírány v různých časových bodech v průběhu 6 měsíců po dávce 1 a 2 (D0 až D164) a post-boost pro skupinu B (D15 k D170) k posouzení humorální odpovědi, včetně ZIKV neutralizačních protilátek pomocí MN50 testu a ZIKV Env a NS1-specifické IgG metodou ELISA.

Pbmc byly shromážděny na počátku, D7, D35, D90, a D164 k posouzení buněčné zprostředkované imunity a paměťové B-buňky reakce.

Úkol s wild-type ZIKV-PR

Pět měsíců po dávce 2 (D176), makaků ve skupinách A, C, D, a šest naivní makakové (skupina E: sham control) byli vyzváni, s 105 plaque forming units (PFU ředit ve fyziologickém roztoku ve fosfátovém pufru (PBS)) wt-ZIKV-PR (kmen PRVABC59 od CDC), subkutánní (SC) injekce do deltového svalu pravé paže a pod anestezii (Zoletil®) (Obr. 1). Challenge dávka a cesta byly vybrány na základě výsledků z předchozí studie (nezveřejněné výsledky).

Biologické odběry post-challenge

Plazmové bylo odebráno každý den po dobu 7 dnů a na D9 a D15 post-výzva pro virologické testy. CSF (100-300 µL) byl odebrán z cisterny magna na D7, D15 a D28 po výzvě. Absence kontaminací krve v mozkomíšním MOKU byla potvrzena pomocí vizuální kontroly a vzorky byly skladovány při -80 °C. Sliny bylo odebráno každý den po dobu 15 dnů a oční tekutiny byly shromážděny s tamponem na D7 a D15 post-challenge. Tampony byly později vloženy do zkumavek obsahujících 500 µL RNA (Invitrogen, USA) a byly smíchány vortexingem. Výtěry byly poté zlikvidovány a eluáty byly uloženy při -80 °C, dokud nebyly analyzovány.

pro imunologické testy byla plazma odebrána ve více časových bodech od D15 do D112 a Pbmc byly odebírány na D35 a D112.

Virózy a virové zátěže v biologických tekutinách post-challenge

ZIKV RNA v plazmě, sliny, oční tekutina a CSF vzorků ze skupiny A, C, D a E byla vyčíslena po výzvě pomocí zásahovou jednotku-PCR zaměřených na NS5 gene22. Celkové genomové RNA byla nejprve extrahována ze vzorků s Macherey Nagel NucleoSpin® 96 virus kit (Macherey Nagel, Německo) na Tecan Evoware automatizované RNA extrakce stanici podle pokynů výrobce a eluována v nuclease-free vody.

Sandwich ELISA pro kvantifikaci ZIKV NS1 antigen

Zbytkové ZIKV NS1 obsah antigenu byla kvantifikována pomocí sandwich ELISA virus přípravu používá pro výzvu. Bylo také měřeno v nezředěném a zředěném (1:30) vzorky plazmy odebrané na začátku, D1, D2, D3, D4 a D5 ze všech napadených skupin jako nepřímá metoda k posouzení replikace viru.

Stručně, 96-well ELISA destičky jsou potaženy myší monoklonální protilátka specifická pro ZIKV NS1 proteinu (klon B-J5 R&D Biotech, Francie) ve fyziologickém roztoku ve fosfátovém pufru 1 × (PBS). Nevázaná místa byla poté blokována po dobu 1 hodiny při 37 °C PBS-Tween20 v 1% mléce (PBS-Tw-M). Desky byly promyty PBS-Tween20 mezi inkubačními kroky. Zkušební vzorky byly sériově naředěn dvojí v PBS-Tw-M a inkubovány v jamkách po dobu 1 h při 37 °C. druhá myší monoklonální protilátka s křenovou peroxidázou (HRP) konjugovaná zaměřena na ZIKV NS1 proteinu (klon B-M6 R&D Biotech, Francie) byl přidán a inkubovány po dobu 90 min při 37 °C. Poté, destičky byly inkubovány ve tmě po dobu 45 min při pokojové teplotě (RT) s připravený-k-použití Tetramethylbenzidin („calamus tebu“ -Bio Laboratories, Francie) substrátu. Reakce byly zastaveny 1 N HCl (VWR Prolabo). Optická hustota (od) byla měřena při 450-650 nm pomocí automatické čtečky desek. Pro stanovení standardní křivky pro stanovení obsahu NS1 v testovaných vzorcích byl použit rekombinantní protein ZIKV NS1 (Native Antigen, UK). Koncentrace proteinu byla stanovena jako průměr všech jednotlivých koncentrací pro rozmezí hodnot od 0,2 až 3,0. Limit detekce (LOD) testu byl 5 ng / ml.

Imunologické testy

Obálka – a NS1-specifické Igg

Obálka – a NS1-specifické Igg byly hodnoceny metodou ELISA v 96jamkové desky potažené rekombinantní protein E (Meridian Life Science Inc., Memphis, USA) nebo rekombinantní nestrukturální protein 1 (NS1) protein (Native Antigen Company, Oxford, UK) v uhličitanovém pufru, pH 9.6. Následující blokování s PBS-Tween20-mléko po dobu 60 min při 37 °C, dvojí zředěné vzorky séra byly přidány, a inkubovány po dobu 90 min při 37 °C. Mycí kroky byly provedeny mezi inkubační kroky s PBS-Tween. Kozí anti-opice IgG HRP-konjugátu (Ref AAI42P, BIO-RAD, Francie) ředěné v PBS-Tw-M 1:5000 bylo přidáno a inkubovány po dobu dalších 90 min při 37 °C než barva rozvoje s substrát tetramethylbenzidin („calamus tebu“ -Bio Laboratories, Le Perray-en-Yvelines, Francie). Optická hustota byla měřena při 450-650 nm pomocí automatické čtečky desek. Titry pro E-specifické IgGs byly vypočteny pomocí anti – zikv opice referenční sérové regresní křivky. Titry pro IGGS specifické pro NS1 byly vypočteny jako reciproční ředění séra s optickou hustotou 1 Pomocí funkce tendence. Titr reference byl dříve vypočítán jako průměr několika stanovení vzájemného ředění s optickou hustotou 1,0. Všechny titry byly vyjádřeny v jednotkách log10 ELISA (EU). Hodnota LOD byla stanovena na 1,3 log10 EU a každému titru pod hodnotou LOD byl přiřazen libovolný titr 1,0 log10.

zikv neutralizační protilátky

pro měření neutralizačních protilátek specifických pro zikv byl použit vysoce výkonný test ZIKV MN5022. Krátce byla tepelně inaktivovaná séra sériově zředěna, smíchána se ZIKV-PR a inkubována při 37 °C po dobu 75 minut. Směsi se pak přenesly na 96jamkové desky obsahující konfluentní verocelulární monovrstvy. Po inkubaci po dobu 5 dnů, infikované buňky byly obarveny s biotinylated pan-flavivirus 4G2 mAb (HB112, Biotem, Francie) a zobrazil s 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitro modrá trifenyltetrazolium v Levamisol substrátu. Pozitivní studny byly definovány jako detekované alespoň jedno barevné infekční zaměření. Pro každé ředění byl zaznamenán celkový počet negativních jamek a reciproční ředění odpovídající 50% virové neutralizace bylo vypočteno metodou nejmenšího čtverce a vyjádřeno jako neutralizační titr log10 MN50.

Paměťové B-buňky enzyme-linked immunospot (ELISpot) test

Kryo-zachovalé Pbmc byly rychle rozmraženy ve 37 °C vodní lázni. Směs fetální telecí sérum (FCS) / Dnázy (100 µg/mL) byl pomalu přidán k Pbmc, než byl přemístěn do RPMIc (RPMI/10% FCS/glutamin/antibiotikách). Po 1 hodině při 37 °C byly Pbmc počítány pomocí sady Viacount Guava podle pokynů výrobce. V Pbmc byly resuspendovány v 1 × 106 buněk/mL v polyklonální stimulace médium obsahující RPMIc s R848 (resiquimod) na 1 µg/mL a IL-2 v 10 ng/mL (jak z Mabtech) a inkubovány při 37 °C s 5% CO2 po dobu 4 dnů umožnit diferenciaci paměťových B-buněk na protilátky-vylučovat buňky (ASC)37.

Sterilní 96-no Multiscreen-IP desky s PVDF membrány (Millipore) byly preinkubovány s 35 µL 35% ethanol, pak třikrát promyty sterilním PBS 1X předtím, než je potažena 100 µL anti-lidské IgG protilátky (Mabtech klon 3850-3-1000) pro detekci celkového IgG vylučují buňky nebo pre-membrána a obálky (prM/Env), virus-like particles (VLP) ZIKV nebo NS1 ZIKV (Nativní Antigen Společnost, UK). Destičky byly inkubovány přes noc při 4 °C a poté se promyje třikrát sterilní 1x PBS a nasycených s RPMIc střední dobu 2 h při 37 °C. RPMIc střední pak byla odstraněna a Pbmc bylo přidáno na 2500 a 5000 buněk v antibody-coated zachytit studny, a za 200 000 a 400 000 buněk v ZIKV prM/Env VIP nebo ZIKV NS1-coated wells, v RPMIc střední. Každá podmínka byla testována ve trojím vyhotovení a destičky byly inkubovány po dobu 20 h při 37 °C s 5% CO2.

desky byly promyty dvakrát v PBS/Tween 20 (0.05%) a třikrát pomocí PBS a inkubovány s biotinylated anti-lidské IgG Ab (Mabtech klon MT78/145-Biotin, Švédsko) na 1 µg/mL v PBS 1 × /0.5% BSA v RT za 1,5 h. Destičky byly dále pětkrát promyty v PBS a byl přidán streptavidin značený fykoerythrinem (Sigma, Francie) zředěný 1:100 0,5% PBS/BSA. Desky byly inkubovány po dobu 1 hodiny při RT, poté šestkrát promyty PBS, sušeny a uchovávány ve tmě. Desky byly čteny pomocí čtečky HLW20 (Microvision Instrument) pomocí softwaru IRIS a analyzovány pomocí kosmického softwaru. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento antigen-specifických asc mezi celkovými IgG asc.

T-buňka ELISpot testy

ZIKV-specifické T-buněčné imunitní odpovědi byly hodnoceny IFNy a IL-5 ELISpot testy pomocí bazény 15-amino-acid (aa), peptidy s 11 aa překrývá pokrývající Env, prM a Kapsidový ZIKV proteiny (JPT, Německo). Krátce, 96-no Multiscreen-IP desky s PVDF membrány (Millipore) byly pre-ošetřené s 35% ethanol, pak potažené přes noc při 4 °C s 100 µL/jamka anti-opičí/lidská IFNy (Mabtech klon MT126L) nebo anti-human IL-5 (Mabtech klon TRFK5) na 10 µg/mL ve sterilním PBS 1×. Po zablokování s RPMIc (RPMI/10% FCS/Glutamin/antibiotikách), 3 × 105 rozmražené Pbmc byly inkubovány ve trojím vyhotovení s 2 µg/mL každého ZIKV peptidy nebo irelevantní peptid bazén (negativní kontrola) v přítomnosti anti-CD28 (mAb CD28.2) a anti-CD49d (mAb 9F10) z Biolegend jako co-stimulátory. Jako pozitivní kontrola byla použita stimulace PHA (Remel)/PMA (SIGMA). Po 18-h inkubaci při 37 °C byly destičky promyty v PBS-BSA 0.5% a inkubovány s biotinylated anti-lidské IFNy (Mabtech klon 7-B6-1) nebo biotinylated anti-human IL-5 (Mabtech klon 5A10) na 1 µg/mL, 100 µL/jamka, po dobu 2 h při pokojové teplotě, ve tmě. Po promytí byly destičky následně inkubovány se streptavidinem-PE (Southern Biotech) po dobu 1 hodiny při RT, ve tmě následovalo šest promývání v PBS-BSA 0,5%.

desky byly čteny pomocí čtečky Hlw20 (Microvision Instrument) pomocí softwaru IRIS a analyzovány pomocí kosmického softwaru. Výsledky byly vyjádřeny jako počet bodově tvořících buněk IFNy nebo IL-5 (SFC) na 106 Pbmc.

statistické metody

všechna data byla před statistickými analýzami transformována. Od D0 do D164 byly analýzy humorálních odpovědí provedeny pomocí podélného modelu analýzy odchylek s opakovanými měřeními v různých časových bodech pro každou opici. Časový efekt byl modelován pomocí kvadratického efektu. Pro modelování efektů výzvy a zvýšení byl pro každé čtení použit podélný model analýzy rozptylu. U každé opice byla v modelu zohledněna opakovaná měření v různých časových bodech. Úpravy Tukey nebo Dunnett byly provedeny pro více srovnání.

pro imunitu zprostředkovanou buňkami byla srovnání mezi skupinami nebo časovými body provedena jednosměrnou ANOVA nebo pomocí podélného modelu v závislosti na biologické otázce.

všechny analýzy byly provedeny pomocí softwaru SAS® v9. 4 na alfa úrovni 0,05. P-hodnoty nižší než tato hodnota indikovaly statisticky významné rozdíly.

Etické aspekty

Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s Asociace pro Hodnocení a Akreditaci Péče o Laboratorní zvířata akreditované zvíře, potřeby, v souladu s Evropskou Směrnicí 2010/63 a francouzské národní předpisy. Protokoly byly schváleny etickou komisí Sanofi Pasteur pro experimentování na zvířatech.

makaků, které byly použity v challenge studie byly humánně utraceno na konci studie (4 měsíce po výzvě) pro biologické důvody, jako ZIKV byl ohlásen být občas přetrvávající v macaques30. Zvířata použitá pro posilovací studii byla znovu použita v jiných výzkumných experimentech.

souhrn hlášení

Další informace o návrhu výzkumu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody, který je spojen s tímto článkem.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.