Ein optimierter gereinigter inaktivierter Zika-Impfstoff bietet anhaltende Immunogenität und Schutz in Cynomolgus-Makaken

ZPIV- und ZPIV-SP-Impfstoffformulierungen

Der ZPIV-Kandidat (klinische Phase-I-Charge) wurde von WRAIR16 bereitgestellt. Der Impfstoff wurde in flüssiger, injektionsfertiger Form mit 5 µg Proteinen pro Dosis (500 µl), entsprechend 200 antigenen Einheiten (AU), mit AlOOH formuliert, geliefert. Der optimierte Impfstoff (ZPIV-SP) wurde bei Sanofi Pasteur (Marcy l’Etoile, Frankreich) unter Verwendung des WRAIR-Verfahrens als Ausgangspunkt mit den folgenden Verbesserungen hergestellt. Kurz gesagt, nach anfänglicher Amplifikation von ZIKV-PR in Sanofi Pasteur Vero-Zellen wurde virale RNA extrahiert und in Sanofi Pasteurs serumfreie (SPSF) Vero-Zellen transfiziert. Das gewonnene Virus wurde amplifiziert, zweimal Plaque-gereinigt und weiter amplifiziert, um eine Pre-Master-Saatgutcharge zu erzeugen, aus der eine Master- und eine Arbeitssamencharge abgeleitet wurden. Das Virus wurde in einem 180 L Bioreaktor unter Verwendung von SPSF Vero Zellen hergestellt. Anschließend wurde das Virus geklärt, durch Ultrazentrifugation mit modifiziertem Cutoff und Chromatographie gereinigt und durch Formalinbehandlung inaktiviert. Die Parameter der Reinigungs- und Inaktivierungsschritte wurden gegenüber den von WRAIR verwendeten Bedingungen optimiert. Das Arzneimittel wurde auf den Antigengehalt der ZIKV-Hülle (E) durch ELISA auf 400 AU / ml (entsprechend 10 µg / ml ZPIV-Proteinen) eingestellt und lyophilisiert. Der lyophilisierte Impfstoff wurde auf 100, 200 oder 400 AU pro Dosis (500 µL) eingestellt und in einem AlOOH—Gel (500 µg / Dosis – Brenntag Biosector, Dänemark) resuspendiert. AU wurde als der durch ELISA gemessene Antigengehalt der Hülle (Env) definiert.

Impfplan

Vier Gruppen von sechs Flavivirus-negativen männlichen Cynomolgus-Makaken (Macaca fascicularis – Noveprim) im Alter von 2 Jahren erhielten 500 µl ZPIV der ersten Generation (Gruppe A: 200 AU) oder optimiertes ZPIV-SP (Gruppe B: 100 AU, Gruppe C: 200 AU oder Gruppe D: 400 AU) intramuskulär (IM) im rechten Quadrizeps am Tag 0 (D0) und der linke Quadrizeps auf D28. Sechs Monate später (D176) erhielten die sechs Makaken der Gruppe B, die 100 AU ZPIV-SP erhalten hatten, eine Auffrischungsdosis derselben Formulierung und wurden 6 Monate lang beobachtet (Abb. 1). Die anderen Gruppen wurden für die virale Herausforderung verwendet.

Klinische Überwachung

Sofortige Reaktionen wurden innerhalb von 30 Minuten beobachtet und mögliche lokale Reaktionen an der Injektionsstelle wurden über die 7 Tage nach jeder Immunisierung beobachtet. Die Makaken wurden jeden Tag überwacht und Symptome wie verminderte Nahrungsaufnahme, eingeschränkte Mobilität, Polypnoe, lokale und systemische Reaktionen wurden während der gesamten Studie aufgezeichnet. Körpergewicht und Körpertemperatur (unter Verwendung von Transponderchips) wurden zu Studienbeginn und in regelmäßigen Abständen während der gesamten Studie aufgezeichnet.

Blutentnahme nach Immunisierung zur Beurteilung der Immunogenität

Seren wurden zu verschiedenen Zeitpunkten über 6 Monate nach Dosis 1 und 2 (D0 bis D164) und nach Boost für Gruppe B (D15 bis D170) gesammelt, um humorale Reaktionen zu bewerten, einschließlich ZIKV-neutralisierender Antikörper durch einen MN50-Assay und ZIKV-Env- und NS1-spezifisches IgG durch ELISA.

PBMCs wurden zu Studienbeginn, D7, D35, D90 und D164 gesammelt, um zelluläre Immunität und Gedächtnis-B-Zell-Reaktionen zu bewerten.

Challenge mit Wildtyp-ZIKV-PR

Fünf Monate nach Dosis 2 (D176) wurden die Makaken der Gruppen A, C, D und sechs naive Makaken (Gruppe E: Scheinkontrolle) mit 105 plaquebildenden Einheiten (PFU verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) von wt-ZIKV-PR (Stamm PRVABC59 von CDC) durch subkutane (SC) Injektion in die Deltamuskelregion des rechten Arms und unter Narkose (Zoletil®) (Abb. 1). Die Herausforderungsdosis und -route wurden basierend auf Ergebnissen einer früheren Studie ausgewählt (unveröffentlichte Ergebnisse).

Biologische Probenahme post-Challenge

Plasma wurde jeden Tag für 7 Tage und auf D9 und D15 Post-Challenge für virologische Assays gesammelt. CSF (100-300 µL) wurde von der cisterna magna auf D7, D15 und D28 Post-Challenge gesammelt. Das Fehlen einer Blutkontamination im Liquor wurde durch visuelle Inspektion bestätigt und die Proben wurden bei -80 ° C gelagert. Speichel wurde jeden Tag für 15 Tage gesammelt und Augenflüssigkeiten wurden mit einem Tupfer auf D7 und D15 nach der Herausforderung gesammelt. Die Tupfer wurden später in Röhrchen mit 500 µL RNA (Invitrogen, USA) gegeben und durch Vortexen gemischt. Die Tupfer wurden dann verworfen, und die Eluate wurden bis zur Analyse bei -80 ° C gelagert.

Für immunologische Assays wurde Plasma zu mehreren Zeitpunkten von D15 bis D112 gesammelt und PBMCs wurden auf D35 und D112 gesammelt.

Virämie und Viruslast in biologischen Flüssigkeiten nach der Belastung

Die ZIKV-RNA in Plasma-, Speichel-, Augenflüssigkeits- und Liquorproben der Gruppen A, C, D und E wurde nach der Belastung mit einer qRT-PCR quantifiziert, die auf das NS5-Gen abzielt22. Die gesamte genomische RNA wurde zunächst mit einem Macherey Nagel NucleoSpin® 96 Virus Kit (Macherey Nagel, Deutschland) auf einer automatisierten Tecan Evoware RNA-Extraktionsstation gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Proben extrahiert und in nukleasefreiem Wasser eluiert.

Sandwich-ELISA zur Quantifizierung des ZIKV-NS1-Antigens

Der verbleibende ZIKV-NS1-Antigengehalt wurde durch einen Sandwich-ELISA in der für die Challenge verwendeten Viruspräparation quantifiziert. Es wurde auch in unverdünntem und verdünntem (1) gemessen:30) Plasmaproben, die zu Studienbeginn gesammelt wurden, D1, D2, D3, D4 und D5 aus allen in Frage gestellten Gruppen als indirekte Methode zur Beurteilung der Virusreplikation.

Kurz gesagt wurden 96-Well-ELISA-Platten mit einem für das ZIKV NS1-Protein spezifischen monoklonalen Mausantikörper (Klon B-J5 R&D Biotech, Frankreich) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung 1 × (PBS) beschichtet. Ungebundene Stellen wurden dann für 1 h bei 37°C mit PBS-Tween20 in 1%iger Milch (PBS-Tw-M) blockiert. Die Platten wurden zwischen den Inkubationsschritten mit PBS-Tween20 gewaschen. Die Testproben wurden seriell zweifach in PBS-Tw-M verdünnt und in den Vertiefungen für 1 h bei 37°C inkubiert. Ein zweites Maus-monoklonales Antikörper-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Konjugat, gerichtet auf ZIKV NS1-Protein (Klon B-M6 R&D Biotech, Frankreich) wurde zugegeben und für 90 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten für 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert (RT) mit einem gebrauchsfertigen Tetramethylbenzidin-Substrat (Tebu-Bio Laboratories, Frankreich). Die Reaktionen wurden mit 1 N HCl (VWR Prolabo) gestoppt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 450-650 nm mit einem automatischen Plattenleser gemessen. Ein ZIKV NS1 rekombinantes Protein (Native Antigen, UK) wurde verwendet, um eine Standardkurve zur Bestimmung des NS1-Gehalts der Testproben zu etablieren. Die Proteinkonzentration wurde als Mittelwert aller Einzelkonzentrationen für den OD-Wertebereich von 0,2 bis 3,0 bestimmt. Die Nachweisgrenze (LOD) des Assays betrug 5 ng/ml.

Immunologische Assays

Hüllkurven- und NS1-spezifische IgGs

Hüllkurven- und NS1-spezifische IgGs wurden mittels ELISA in 96-Well-Platten untersucht, die mit rekombinantem E-Protein (Meridian Life Science Inc., Memphis, USA) oder rekombinantes Nichtstrukturprotein 1 (NS1) Protein (Native Antigen Company, Oxford, UK) in Carbonatpuffer, pH 9,6. Nach Blockierung mit PBS-Tween20-Milch für 60 min bei 37°C wurden zweifach verdünnte Serumproben zugegeben und für 90 min bei 37°C inkubiert. Zwischen den Inkubationsschritten wurden Waschschritte mit PBS-Tween durchgeführt. Ein Ziegen-Anti-Affen-IgG-HRP-Konjugat (Ref AAI42P, BIO-RAD, Frankreich), verdünnt in PBS-Tw-M bei 1:5000, wurde zugegeben und für weitere 90 min bei 37°C vor der Farbentwicklung mit Tetramethylbenzidinsubstrat (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, Frankreich) inkubiert. Die optische Dichte wurde bei 450-650 nm mit einem automatischen Plattenleser gemessen. Titer für E-spezifische IgGs wurden unter Verwendung einer Anti-ZIKV-Affen-Referenzserum-Regressionskurve berechnet. Titer für NS1-spezifische IgGs wurden als reziproke Verdünnung des Serums berechnet, die unter Verwendung der Tendenzfunktion eine optische Dichte von 1 ergab. Der Titer der Referenz wurde zuvor als Mittelwert mehrerer Bestimmungen der reziproken Verdünnung berechnet, wobei eine optische Dichte von 1,0 erhalten wurde. Alle Titer wurden in log10 ELISA-Einheiten (EU) ausgedrückt. Die LOD wurde auf 1,3 log10 EU eingestellt und jedem Titer unterhalb der LOD ein beliebiger Titer von 1,0 log10 zugewiesen.

ZIKV-neutralisierende Antikörper

Zur Messung ZIKV-spezifischer neutralisierender Antikörper wurde ein Hochdurchsatz-ZIKV-MN50-Assay verwendet22. Kurzzeitig wurden hitzeinaktivierte Seren seriell verdünnt, mit ZIKV-PR gemischt und 75 min bei 37°C inkubiert. Die Mischungen wurden dann auf 96-Well-Platten übertragen, die konfluente Vero-Zell-Monoschichten enthielten. Nach 5-tägiger Inkubation wurden infizierte Zellen mit biotinyliertem Pan-flavivirus 4G2 mAb (HB112, Biotem, Frankreich) gefärbt und mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitro blue tetrazolium in Levamisol-Substrat visualisiert. Positive Wells wurden definiert als mindestens ein farbiger infektiöser Fokus detektiert. Für jede Verdünnung wurde die Gesamtzahl der negativen Vertiefungen aufgezeichnet und die reziproke Verdünnung, die 50% der Virusneutralisation entspricht, unter Verwendung der Methode mit dem kleinsten Quadrat berechnet und als Neutralisationstiter log10 MN50 ausgedrückt.

Memory B-cell enzyme-linked immunospot (EliSpot) Assay

Kryokonservierte PBMCs wurden schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut. Eine Mischung aus fötalem Kälberserum (FCS) / DNase (100 µg / ml) wurde langsam zu den PBMCs gegeben, bevor sie auf RPMIc (RPMI / 10% FCS / Glutamin / Antibiotika-Cocktail) übertragen wurde. Nach 1 h bei 37°C wurden PBMCs mit dem ViaCount Guava Kit nach Herstellerangaben gezählt. Die PBMCs wurden mit 1 × 106 Zellen / ml in polyklonalem Stimulationsmedium, das RPMIc mit R848 (Resiquimod) mit 1 µg / ml und IL-2 mit 10 ng / ml (beide von Mabtech) enthielt, resuspendiert und bei 37 ° C mit 5% CO2 für 4 Tage inkubiert, um eine Differenzierung von Speicher-B-Zellen in Antikörper-sekretierende Zellen (ASC) zu ermöglichen 37.

Sterile 96-Well Multiscreen-IP-Platten mit PVDF-Membranen (Millipore) wurden mit 35 µL 35% igem Ethanol vorinkubiert, dann dreimal mit sterilem PBS 1X gewaschen, bevor sie mit 100 µL eines humanen Anti-IgG-Antikörpers (Mabtech-Klon 3850-3-1000) beschichtet wurden, um insgesamt IgG-sekretierende Zellen oder virusähnliche Partikel (VLP) Vormembran und Hülle (prM / Env) nachzuweisen ZIKV oder NS1 ZIKV The Native Antigen Company, Vereinigtes Königreich). Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert und anschließend dreimal mit sterilem 1x PBS gewaschen und 2 h bei 37°C mit RPMIc-Medium gesättigt. RPMIc-Medium wurde dann entfernt und PBMCs wurden bei 2500 und 5000 Zellen in den Antikörper-beschichteten Capture-Wells und bei 200.000 und 400.000 Zellen in den ZIKV prM / Env VLP- oder ZIKV NS1-beschichteten Wells in RPMIc-Medium zugegeben. Jede Bedingung wurde in dreifacher Ausfertigung getestet und die Platten wurden für 20 h bei 37 °C mit 5% CO2 inkubiert.

Die Platten wurden zweimal in PBS/Tween 20 (0,05%) und dreimal mit PBS gewaschen und mit einem biotinylierten Anti-Human IgG Ab (Mabtech Klon MT78/145-Biotin, Schweden) bei 1 µg/ml in PBS 1×/0,5% BSA bei RT für 1,5 h inkubiert. Die Platten wurden weiter fünfmal in PBS gewaschen und Phycoerythrin-markiertes Streptavidin (Sigma, Frankreich) verdünnt 1:100 mit 0,5% PBS/BSA zugegeben. Die Platten wurden 1 h bei RT inkubiert, dann sechsmal mit PBS gewaschen, getrocknet und im Dunkeln gehalten. Die Platten wurden mit dem HLW20-Reader (Microvision Instrument) unter Verwendung der IRIS-Software gelesen und mit der Cosmic-Software analysiert. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der antigenspezifischen ASCs unter den gesamten IgG-ASCs ausgedrückt.

T-Zell-EliSpot-Assays

ZIKV-spezifische T-Zell-Immunantworten wurden durch IFNy- und IL-5-EliSpot-Assays unter Verwendung von Pools von 15-Aminosäure (aa) -Peptiden mit 11 aa-Überlappungen bewertet, die die Env-, prM- und Kapsid-ZIKV-Proteine abdecken (JPT, Deutschland). Kurz gesagt, 96-Well Multiscreen-IP-Platten mit PVDF-Membranen (Millipore) wurden mit 35% Ethanol vorbehandelt, dann über Nacht bei 4 ° C mit 100 µL / Well Anti-Affen / Human-IFNy (Mabtech-Klon MT126L) oder Anti-Human-IL-5 (Mabtech-Klon TRFK5) bei 10 µg / ml in sterilem PBS 1 × beschichtet. Nach Blockierung mit RPMIc (RPMI/10% FCS/Glutamin/Antibiotikacocktail) wurden 3× 105 aufgetaute PBMCs mit je 2 µg/ml ZIKV-Peptiden oder einem irrelevanten Peptidpool (Negativkontrolle) in Gegenwart von Anti-CD28 (mAb CD28.2) und Anti-CD49d (mAb 9F10) von Biolegend als Co-Stimulatoren dreifach inkubiert. PHA (Remel)/PMA (SIGMA)-Stimulation wurde als Positivkontrolle verwendet. Nach einer 18-stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Platten in PBS-BSA 0 gewaschen.5% und inkubiert mit biotinyliertem Anti-Human-IFNy (Mabtech-Klon 7-B6-1) oder biotinyliertem Anti-Human-IL-5 (Mabtech-Klon 5A10) bei 1 µg/ml, unter 100 µL/well, für 2 h bei RT, im Dunkeln. Nach dem Waschen wurden die Platten anschließend mit Streptavidin-PE (Southern Biotech) für 1 h bei RT im Dunkeln inkubiert, gefolgt von sechs Wäschen in PBS-BSA 0,5%.

Die Platten wurden mit dem HLW20-Reader (Microvision Instrument) unter Verwendung der IRIS-Software gelesen und mit der Cosmic-Software analysiert. Die Ergebnisse wurden als Anzahl der IFNy- oder IL-5-punktbildenden Zellen (SFC) pro 106 PBMCs ausgedrückt.

Statistische Methoden

Alle Daten wurden vor statistischen Analysen log-transformiert. Von D0 bis D164 wurden die Analysen der humoralen Reaktionen unter Verwendung eines longitudinalen Modells der Varianzanalyse mit wiederholten Messungen zu verschiedenen Zeitpunkten für jeden Affen durchgeführt. Der Zeiteffekt wurde mit einem quadratischen Effekt modelliert. Um die Challenge- und Boost-Effekte zu modellieren, wurde für jedes Auslesen ein longitudinales Modell der Varianzanalyse verwendet. Für jeden Affen wurden wiederholte Messungen zu verschiedenen Zeitpunkten im Modell berücksichtigt. Tukey- oder Dunnett-Anpassungen wurden für mehrere Vergleiche durchgeführt.

Für die zellvermittelte Immunität wurden Vergleiche zwischen Gruppen oder Zeitpunkten durch eine Einweg-ANOVA oder unter Verwendung eines longitudinalen Modells in Abhängigkeit von der biologischen Fragestellung durchgeführt.

Alle Analysen wurden mit der Software SAS® v9.4 mit einem Alpha-Level von 0,05 durchgeführt. P-Werte kleiner als dieser Wert zeigten statistisch signifikante Unterschiede an.

Ethische Überlegungen

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited animal Facilities in Übereinstimmung mit der Europäischen Richtlinie 2010/63 und den nationalen französischen Vorschriften durchgeführt. Die Protokolle wurden von der Ethikkommission von Sanofi Pasteur für Tierversuche genehmigt.

Die Makaken, die in der Challenge-Studie verwendet wurden, wurden am Ende der Studie (4 Monate nach der Challenge) aus Gründen der biologischen Sicherheit human eingeschläfert, da ZIKV in Makaken gelegentlich persistent ist30. Tiere, die für die Booster-Studie verwendet wurden, wurden in anderen Forschungsexperimenten wiederverwendet.

Berichtszusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.

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