Keystone-Virus isoliert von einem Teenager in Florida mit Hautausschlag und hohem Fieber: Ein weiteres endemisches Arbovirus im Südosten der Vereinigten Staaten?

Zusammenfassung

Das Keystone-Virus, ein Orthobunyavirus der kalifornischen Serogruppe, wurde erstmals 1964 aus Mücken in Keystone, Florida, isoliert. Es gab keine früheren Berichte über eine Isolierung vom Menschen, obwohl Studien darauf hindeuteten, dass ~ 20% der in der Region lebenden Personen seropositiv sind. Wir berichten über die Virusisolation eines Teenagers aus Florida mit Hautausschlag und Fieber.Die Entstehung des Zika-Virus (ZIKV) und die fortlaufende Identifizierung von Infektionen mit dem Chikungunya-Virus und dem Dengue-Virus haben zu zunehmenden Bedenken hinsichtlich der Endemizität und Ausbreitung von Arboviren in den Vereinigten Staaten geführt. Keystone Virus (KEYV; gattung Orthobunyavirus, Familie Peribunyaviridae), ein Mitglied der Orthobunyavirus California Serogruppe, wurde erstmals 1964 aus Mücken in Keystone, Florida (in der Nähe von Tampa Bay) isoliert . Nachfolgende Studien zeigten eine weit verbreitete Verbreitung des Virus bei Moskitos, insbesondere Aedes atlanticus, sowie bei Eichhörnchen, Waschbären, und Weißwedelhirsche, in Küstenregionen, die sich von der Chesapeake Bay nach Süden durch Florida erstrecken, und so weit westlich wie Texas .

In Studien, die in den 1960er Jahren an menschlichen Populationen durchgeführt wurden, lagen die Seropositivitätsraten im Bereich von 19-21% . Die tatsächliche Isolierung von KEYV vom Menschen wurde jedoch nie zuvor berichtet, noch wurde KEYV mit einem klinischen Syndrom beim Menschen in Verbindung gebracht, trotz seiner offensichtlichen Endemizität bei Tieren und Mücken.

FALLBERICHT

Ein 16-jähriger, zuvor gesunder Mann wurde im August 2016 einer Notfallklinik in Nord-Zentral-Florida mit einer Vorgeschichte von leichtem Fieber und einem diffusen Hautausschlag vorgestellt. Der Patient berichtete, dass er sich am Abend zuvor „warm“ fühlte, mit einer Temperatur, die von seinen Eltern auf ~ 100 ° F geschätzt wurde. Am Morgen der Präsentation trat ein erythematöser papulöser Ausschlag auf, der auf seiner Brust begann und sich allmählich auf Bauch, Arm, Rücken und Gesicht ausbreitete. Es gab keine Bläschen, und der Ausschlag war schmerzlos und nicht juckend. Es wurde durch Hitze und Sonnenlicht verschlimmert. Der Patient hat Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Nackensteifheit oder gastrointestinale Symptome. Er bemerkte leichte Müdigkeit und Knöchelbeschwerden, was er der gleichzeitigen Teilnahme an einem Sommercamp für Blaskapellenteilnehmer zuschrieb, neue Bandschuhe tragen. In der Vorwoche war bei dem Patienten eine mögliche Mandelentzündung diagnostiziert worden und er hatte eine Therapie mit Amoxicillin in einer Menge von 500 mg erhalten, die 3-mal täglich oral eingenommen wurde und die er am folgenden Tag selbst abgesetzt hatte. Er hatte keine relevante medizinische oder chirurgische Vorgeschichte; keine bekannten immunsuppressiven oder angeborenen Erkrankungen; keine bekannten Allergien; keine kürzlichen Reisen außerhalb Zentralfloridas; und keine Exposition gegenüber Farmen oder Nutztieren. Er hatte alle empfohlenen Impfungen für Kinder erhalten. Andere Familienmitglieder waren nicht krank. Der Patient und seine Familie waren 4 Jahre vor der gemeldeten Krankheit von Kansas (wo das Keystone-Virus nicht identifiziert wurde) nach Florida gezogen. Das Bandcamp, an dem er teilnahm, dauerte bis in den Abend hinein und er berichtete, dass er trotz der Anwendung von Diethyltoluamid (allgemein bekannt als DEET) mehrmals von Moskitos gebissen wurde.Bei der Untersuchung in der Klinik hatte er eine Temperatur von 98,5 ° F (36,9 ° C), einen Puls von 69 Schlägen / Minute, eine Atemfrequenz von 12 Atemzügen / Minute und einen Blutdruck von 122/82 mm / Hg. Ein diffuser, erythematöser, papulöser Ausschlag an Rumpf, Arm und Gesicht wurde festgestellt (Abbildung 1). Die Kopf-, Hals-, Atemwegs-, Herz-Kreislauf- und Bauchuntersuchungen des Patienten waren normal. Ein in der Klinik durchgeführter Monospot-Schnelltest war negativ. Mit Zustimmung des Patienten und seiner Eltern wurden Speichel- und Urinproben entnommen. Der Ausschlag verschwand 2 Tage später ohne weiteres Fieber. Er hat nachher Amoxicillin ohne Aussehen eines Hautausschlags genommen.

VIRALE IDENTIFIZIERUNG / ISOLIERUNG

Reverse Transkription Polymerase Chain Reaction Screens

Da der Patient während eines Zeitraums, in dem ein ZIKV-Ausbruch in Florida auftrat, Hautausschlag und Fieber in der Anamnese aufwies, wurden Speichel- und Urinproben getestet und waren negativ für ZIKV, Chikungunya-Virus und Dengue-Virus Serotyp 1-4 genomische Ribonukleinsäure (RNA) durch reverse Transkription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) . Die Möglichkeit einer Alphavirus- oder Flavivirus-Ätiologie wurde weiter untersucht, indem RT-PCR unter Verwendung von Universalprimern durchgeführt wurde, die Alphaviren und Flaviviren in Brasilien nachweisen . Sowohl Speichel- als auch Urinproben wurden negativ auf Alphavirus- und Flavivirus-vRNAs getestet, während Positivkontrollen wie erwartet funktionierten (Daten nicht gezeigt).

Unvoreingenommene Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung zur Identifizierung eines mutmaßlichen viralen ätiologischen Agens

Eine vermutliche Virusidentität wurde nach einer Modifikation eines zuvor beschriebenen Verfahrens erhalten ; detaillierte Methoden sind in den ergänzenden Daten zu diesem Papier enthalten. Virale genomische RNA (und/oder Desoxyribonukleinsäure) wurden mit einem QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen Inc.). PCR-Amplikons wurden gereinigt (Qiagen QIAquick PCR Purification Kit) und mit Taq-DNA-Polymerase (New England Biolabs) A-tailed. Die A-Tailed-PCR-Amplikons wurden dann TA-kloniert und die Inserts mit Sanger-Sequenzierung sequenziert. Von insgesamt 40 Plasmiden mit TA-klonierten Inserts (20 Inserts aus Urin, 20 aus Speichel) enthielt 1 aus Urin einen 166-bp-Insert mit einer 99% igen Identität von Keystone-Virus-Small-Genome-Sequenzen, die mit GenBank (KT630293.1, U12801.1 und KT630290.1) deponiert wurden.

Direkte Sequenzierung des Keystone-Virus im Urin

Da es zahlreiche Orthobunyaviren gibt und veröffentlichte RT-PCR-Primer zur Sequenzierung von KEYV nicht verfügbar waren, wurde das Virus mit speziell entwickelten Primern sequenziert, die auf 3 verfügbaren, vollständigen Keystone-Virus-Genomen in GenBank basieren. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung einer Genom-Walking-Strategie mit den in der ergänzenden Tabelle 1 beschriebenen PCR-Primern; Unsere vollständigen Methoden sind in den ergänzenden Daten enthalten. Die Sequenz wurde als KEYV / Homo sapiens / Gainesville-1/2016 bezeichnet; die 3 Genomsegmentsequenzen wurden in der GenBank unter den Zugangsnummern MH016784 (großes Segment), MH016785 (mittleres Segment) und MH016786 (kleines Segment) hinterlegt. Die vollständige L-Genomsequenz weist 98 bis 99% Identitäten mit den entsprechenden Genomen der nur 3 anderen vollständigen Keystone-Virus-L-Sequenzen auf, die in Genbank (KT630288.1, KX817321.1 und KT630291.1). In ähnlicher Weise hat das vollständige M-Genom 98 bis 99% mit den entsprechenden M-Sequenzen (AF123489.1, KT630289.1 und KX817322.1) und 99% mit den entsprechenden S-Genomsequenzen (KT630293.1, U12801.1 und KT630290.1) gemeinsam.

Isolierung und Visualisierung des Keystone-Virus in kultivierten Zellen

Da die Keystone-Virus-vRNA durch unvoreingenommene Sequenzierung nachgewiesen wurde (und später vollständig sequenziert wurde), wurde versucht, das Virus in einer Zelllinie zu isolieren, von der bekannt ist, dass sie ihr Wachstum unterstützt (Vero-Zellen) und in der Maus-Neuroblastom-Zelllinie Neuro-2A; eine Beschreibung der vollständigen Methoden finden Sie in den ergänzenden Daten. Virusinduzierte gemischte zytopathische Effekte (CPE) zeigten sich in Neuro-2A-Zellen 2 Tage nach der Inokulation der Zellen mit Urin, jedoch nicht mit Speichel, und dasselbe wurde 1 Tag später in Vero E6-Zellen beobachtet. Bei der Subkultur waren CPE 2 Tage nach der Inokulation von Vero E6-Zellen mit verbrauchten Medien aus Urin-inokuliertem Neuro-2A offensichtlich. Das in Vero E6-Zellen gebildete KEYV-induzierte CPE ist in den ergänzenden Abbildungen S1A und S1B dargestellt; beide ursprünglichen Urin-inokulierten Vero E6- und Vero E6-Zellen, die mit virusinfizierten Neuro-2A-Zellen inokuliert waren, bildeten den gleichen Typ von CPE. Überstände der virusinfizierten Zellen waren durch RT-PCR positiv für KEYV-vRNA, während diejenigen von mock-inokulierten Kontrollen negativ für KEYV-vRNA waren.

Um eine aktive Keystone-Virusreplikation zu demonstrieren, wurden Vero E6-Zellen mit signifikantem CPE (>70% der infizierten Zellmonoschicht) 40 Stunden nach der Infektion durch Transmissionselektronenmikroskopie analysiert und zeigten typisches Bunyavirus-induziertes CPE und die Produktion von Nachkommenvirionen. Methoden und Bilder (ergänzende Abbildungen S2A-F) sind in den ergänzenden Daten enthalten.

KOMMENTAR

KEYV, ein Einzelstrang-RNA-Virus mit negativem Sinn, wird im Allgemeinen in die sogenannte „California Serogroup“ der Gattung Orthobunyavirus eingeteilt, zu der unter anderem das California Encephalitis Virus, das Jamestown Canyon Virus und das La Crosse Encephalitis Virus gehören. KEYV, basierend auf Studien, die in den 1960er und 1970er Jahren durchgeführt wurden, scheint in Küstengebieten des Südostens der Vereinigten Staaten weit verbreitet zu sein, wobei Isolate (in Mücken- und Tierproben) von der Chesapeake Bay bis nach Texas identifiziert wurden. Der Organismus scheint eine Reihe von Wirbeltierwirten zu haben, darunter, wie bereits erwähnt, das Grauhörnchen (30% Seropositivität in einer Studie im Pokomoke Cypress Swamp in Maryland), Waschbären (18% seropositiv in derselben Studie) und Weißwedelhirsche (10% seropositiv in der Maryland-Studie; 2% seropositiv in einer Studie in Texas); Es scheint in Vogel- oder Reptilienpopulationen selten zu sein. Das Virus kann in Mücken transovarial übertragen werden, wobei A. atlanticus ein Primärvektor zu sein scheint (obwohl KEYV bei anderen Aedes- und Culex-Arten identifiziert wurde). Das Bild, das sich ergibt, ist das eines Virus, das in Moskitos und anderen Wirbeltieren endemisch ist, wenn auch von unsicherer klinischer Bedeutung in Tierpopulationen.

Es stellt sich also die Frage nach der Relevanz von KEYV für den Menschen. Seroprävalenzstudien, die vor 50 Jahren mit viralen Neutralisationstests durchgeführt wurden, deuteten darauf hin, dass die Seropositivität in gesunden menschlichen Populationen im Bereich von 20% lag . Unsere Daten zeigten, dass Infektionen beim Menschen auftreten können (und immer noch), wobei lebensfähige Viren im Urin nachweisbar sind. Wir können zwar nicht definitiv sagen, dass das Virus für den Hautausschlag und das gemeldete Fieber verantwortlich war, Unsere Daten sind eindeutig suggestiv, und erhöhen die Möglichkeit, dass ein Teil der ansonsten unauffälligen Hautausschlag- und Fieberfälle in der Grundversorgung in Küstengebieten der Südosten der Vereinigten Staaten spiegeln tatsächlich HCV-Infektionen wider. Viele der Viren in der kalifornischen Gruppe wurden mit Enzephalitis in Verbindung gebracht, und wie in diesem Bericht gezeigt, wächst das Virus gut in Neuroblastomzelllinien; in Fällen von viraler Enzephalitis, in denen keine Ätiologie festgestellt wird, kann es sich auch lohnen, nach HCV-Infektionen zu suchen. Im aktuellen Fall führte eine umfassende virologische Bewertung im Zusammenhang mit Bedenken hinsichtlich einer ZIKV-Infektion zur Isolierung des Virus; Es ist höchst unwahrscheinlich, dass es außerhalb eines ähnlichen Forschungsumfelds jemals identifiziert worden wäre. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Vielfalt potenzieller arboviraler Pathogene in dieser Region und legen nahe, dass eine umfassende Analyse möglicher viraler Pathogene die Diagnostik von KEYV umfassen sollte.

Ergänzende Daten

Ergänzende Materialien sind bei Clinical Infectious Diseases online verfügbar. Die veröffentlichten Materialien bestehen aus Daten, die von den Autoren zum Nutzen des Lesers bereitgestellt werden, und werden nicht kopiert und liegen in der alleinigen Verantwortung der Autoren.

Anmerkungen

Finanzielle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch interne Mittel des Emerging Pathogens Institute der University of Florida und des Department of Environmental and Global Health, College of Public Health and Health Professions, unterstützt.

Mögliche Interessenkonflikte. Alle Autoren: Keine gemeldeten Interessenkonflikte. Alle Autoren haben das ICMJE-Formular zur Offenlegung potenzieller Interessenkonflikte eingereicht. Konflikte, die die Herausgeber für den Inhalt des Manuskripts für relevant halten, wurden offengelegt.Ich habe mich sehr gefreut, als ich das erste Mal in meinem Leben war, als ich noch nie in meinem Leben so viel Zeit hatte.

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