az optimalizált tisztított inaktivált Zika vakcina tartós immunogenitást és védelmet nyújt a cynomolgus macaques

ZPIV és ZPIV-SP vakcina készítményekben

a ZPIV jelöltet (fázis I. klinikai tétel) a WRAIR16 biztosította. A vakcinát folyékony formában, injekcióra készen, adagonként 5 6 g fehérjével (500 ml) szállítottuk, ami 200 antigén egységnek (AU) felel meg, AlOOH-val formulálva. Az optimalizált vakcinát (ZPIV-SP) a Sanofi Pasteur-ban (Marcy l ‘ Etoile, Franciaország) készítették a WRAIR folyamat kiindulópontjaként a következő fejlesztésekkel. Röviden, A Zikv-PR kezdeti amplifikációja után a Sanofi Pasteur Vero sejtekben a vírus RNS-t kivonták és transzfektálták a Sanofi Pasteur szérummentes (SPSF) Vero sejtjeibe. A visszanyert vírust felerősítettük, a plakkot kétszer megtisztítottuk, majd tovább erősítettük, hogy létrehozzunk egy pre-Master vetőmag-tételt, amelyből egy Master és egy működő vetőmag-tétel származik. A vírust 180 literes bioreaktorban állították elő SPSF Vero sejtek felhasználásával. A vírust ezután tisztítottuk, ultracentrifugációval, módosított cut-off-tal és kromatográfiával tisztítottuk, majd formalinkezeléssel inaktiváltuk. A tisztítási és inaktiválási lépések paramétereit a WRAIR által használt körülményekhez képest optimalizáltuk. A gyógyszerkészítményt a ZIKV burok (E) antigéntartalmához ELISA-val 400 AU/mL-re (ami 10 6G/mL zpiv proteinnek felel meg) állítottuk be és liofilizáltuk. A liofilizált vakcinát adagonként 100, 200 vagy 400 AU—ra állítottuk be (500 6/l), és egy AlOOH gélben reszuszpendáltuk (500 g / adag-Brenntag Biosector, Dánia). Az AU-t az ELISA-val mért boríték (Env) antigéntartalomként határozták meg.

oltási séma

négy, 2 éves, hat flavivírus-negatív hím cynomolgus makákó (Macaca fascicularis – Noveprim) csoport 500 db első generációs ZPIV-t (a csoport: 200 AU) vagy optimalizált ZPIV-SP-t (B csoport: 100 AU, C csoport: 200 AU vagy D csoport: 400 AU) kapott intramuscularisan (IM) a jobb quadricepsben a 0.napon (D0), valamint a jobb oldali quadriceps-ben (A. csoport: a bal quadriceps a D28-on. Hat hónappal később (D176) a B csoportba tartozó hat makákó, akik 100 AU ZPIV-SP-t kaptak, ugyanabból a gyógyszerformából kapott emlékeztető dózist kaptak, és 6 hónapig követték őket (ábra. 1). A többi csoportot a vírusos kihíváshoz használták.

klinikai monitorozás

azonnali reakciókat figyeltek meg 30 percen belül, és potenciális helyi reakciókat figyeltek meg az injekció beadásának helyén az immunizálást követő 7 napon belül. A makákókat minden nap monitorozták, és a vizsgálat során olyan tüneteket regisztráltak, mint a csökkent táplálékfelvétel, a mozgáskorlátozottság, a polypnea, a helyi és szisztémás reakciók. A vizsgálat megkezdésekor és a vizsgálat során rendszeres időközönként feljegyezték a testtömeget és a testhőmérsékletet (transzponder chipek segítségével).

vérmintavétel az immunogenitás értékeléséhez

a szérumokat különböző időpontokban gyűjtötték 6 hónap alatt az 1.és 2. dózis (D0-D164) és a B csoport (D15-D170) utáni boost után a humorális válaszok értékelésére, beleértve a ZIKV semlegesítő antitesteket MN50 assay-vel és a ZIKV Env és NS1-specifikus IgG-t ELISA-val.

pbmc-ket gyűjtöttek a vizsgálat megkezdésekor, D7, D35, D90 és D164 a celluláris mediált immunitás és memória B-sejt válaszok értékelésére.

kihívás vad típusú ZIKV-PR-vel

öt hónappal a 2.adag beadása után (D176) az A, C, D csoportba tartozó makákókat és hat naiv makákót (e csoport: színlelt kontroll) 105 plakkképző egységgel (PFU foszfát-pufferelt sóoldattal hígítva (PBS)) a wt-ZIKV-PR-ből (PRVABC59 törzs a CDC-től) szubkután (SC) injekcióval a jobb kar deltoid régiójában, és altatásban (zoletil) (ábra. 1). A provokációs dózist és az útvonalat egy korábbi vizsgálat eredményei alapján választották ki (nem publikált eredmények).

biológiai mintavételeket a provokáció után

plazmát gyűjtöttek minden nap 7 napon keresztül, valamint a provokáció utáni D9 és D15-en virológiai vizsgálatokhoz. A CSF-et (100-300 Ft) A cisterna magna-ból gyűjtötték a D7-es, D15-ös és D28-as vizsgálat után. A CSF-ben a vér szennyeződésének hiányát szemrevételezéssel igazolták, és a mintákat -80 C-nél tárolták. a nyálat minden nap 15 napig gyűjtötték, a szemfolyadékokat pedig tamponnal gyűjtötték a D7-en és a D15-en a kihívás után. A tamponokat később 500 MHz RNS-t tartalmazó csövekbe helyeztük (Invitrogen, USA), és örvényléssel kevertük. A tamponokat ezután eldobtuk, az eluátumokat pedig -80cc-n tároltuk az elemzésig.

az immunológiai vizsgálatokhoz a plazmát több időpontban, a D15-től a D112-ig, a Pbmc-ket pedig a D35-en és a D112-en gyűjtötték.

Viremia és vírusterhelés a biológiai folyadékokban a provokáció után

az A, C, D és E csoportból származó plazmában, nyálban, szemfolyadékban és CSF mintákban a zikv RNS-t a provokáció után az NS5 gene22-t célzó qRT-PCR segítségével számszerűsítették. A teljes genomiális RNS-t először a Macherey Nagel Nukleospin ~ 96 víruskészlettel (Macherey Nagel, Németország) vonták ki a mintákból egy Tecan Evoware automatizált RNS-extrakciós munkaállomáson a gyártó utasításainak megfelelően, majd nukleázmentes vízben eluálták.

szendvics Elisa a zikv NS1 antigén mennyiségi meghatározására

a zikv NS1 maradék antigéntartalmát szendvics ELISA-val határoztuk meg a fertőzéshez használt víruskészítményben. Azt is mért hígítatlan és hígított (1:30) a kiindulási D1, D2, D3, D4 és D5 plazmamintákat minden vizsgált csoportból közvetett módszerként a vírusreplikáció értékelésére.

röviden, 96-well ELISA lemezeket vontunk be a ZIKV NS1 fehérjére specifikus egér monoklonális antitesttel (clone B-J5 r&D Biotech, Franciaország) foszfát-pufferelt sóoldatban 1 (PBS). A nem kötött helyeket ezután 1 órán át blokkolták 37-nél 6CC-nél PBS-Tween20-mal 1% tejben (PBS-Tw-M). A lemezeket PBS-Tween20-Mal mossuk az inkubációs lépések között. A tesztmintákat kétszeresen hígítottuk PBS-Tw-M-ben, és 1 órán át inkubáltuk a kutakban 37 C. a zikv NS1 fehérjéhez irányított második egér monoklonális antitest torma peroxidáz (HRP)-konjugátumot (B-M6 r klón&D Biotech, Franciaország) adtunk hozzá, és 90 percig inkubáltuk 37 Kb C. Ezután a lemezeket sötétben inkubáltuk 45 percig szobahőmérsékleten (rt) használatra kész tetrametil-benzidin (tebu-bio Laboratories, Franciaország) szubsztráttal. A reakciókat 1 N HCl (VWR Prolabo) alkalmazásával leállították. Az optikai sűrűséget (OD) 450-650 nm-en mértük automatikus lemezolvasóval. Egy zikv NS1 rekombináns fehérjét (natív antigén, Egyesült Királyság) használtunk egy standard görbe létrehozásához a vizsgálati minták NS1 tartalmának meghatározásához. A fehérjekoncentrációt az összes egyedi koncentráció átlagaként határoztuk meg a 0,2-3,0 OD értéktartományban. A vizsgálat kimutatási határa (LOD) 5 ng/mL volt.

immunológiai vizsgálatok

boríték – és NS1-specifikus IgG – ket

A boríték-és NS1-specifikus IgG-ket ELISA-val értékelték rekombináns e fehérjével bevont 96 kútlemezeken (Meridian Life Science Inc., Memphis, USA) vagy rekombináns nem strukturális fehérje 1 (NS1) fehérje (Native Antigen Company, Oxford, Egyesült Királyság) karbonát pufferben, pH 9,6. A PBS-Tween20-tej 60 percen át történő blokkolását követően 37cc-n, kétszer hígított szérummintákat adtunk hozzá, és inkubáltuk 90 percig 37ccc-n. a PBS-Tween inkubációs lépései között mosási lépéseket végeztünk. Egy kecske majomellenes IgG HRP-konjugátumot (Ref Aai42p, BIO-RAD, Franciaország) 1:5000 arányban PBS-Tw-M-ben hígítottak, majd további 90 percig inkubáltuk 37 Kb-on, mielőtt tetrametil-benzidin szubsztráttal (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, Franciaország) színfejlesztést végeztünk. Az optikai sűrűséget 450-650 nm-en mértük automatikus lemezolvasóval. Az E-specifikus IgG-k titereit egy anti-zikv majom referencia szérum regressziós görbével számítottuk ki. Az NS1-specifikus IgG-k titereit a szérum reciprok hígításaként számítottuk ki, amely 1 optikai sűrűséget adott a tendencia függvény alkalmazásával. A referencia titerét korábban a kölcsönös hígítás több meghatározásának átlagaként számítottuk ki, így az optikai sűrűség 1,0 volt. Az összes titert log10 ELISA egységben (EU) fejezték ki. A LOD-t 1,3 log10 EU-ban határozták meg, és a LOD alatti minden titerhez tetszőleges 1,0 log10 titert rendeltek.

ZIKV semlegesítő antitestek

a zikv-specifikus semlegesítő antitestek mérésére nagy áteresztőképességű ZIKV MN50 vizsgálatot használtunk22. Röviden, a hő-inaktivált szérumokat sorozatosan hígítottuk, zikv-PR-vel kevertük, és 37 6CC-on 75 percig inkubáltuk. A keverékeket ezután 96 lyukú lemezekre helyeztük át, amelyek összefolyó Vero sejtes egyrétegeket tartalmaznak. Az 5 napos inkubációt követően a fertőzött sejteket biotinilezett pan-flavivirus 4G2 mAb-val (HB112, Biotem, Franciaország) festettük, és levamizol szubsztrátban 5-bróm-4-klór-3-indolilfoszfát/nitro-kék tetrazoliummal vizualizáltuk. A pozitív kutakat legalább egy színes fertőző fókuszként határozták meg. Minden hígításnál feljegyeztük a negatív kutak teljes számát, és a virális semlegesítés 50% – ának megfelelő reciprok hígítást a legkisebb négyzet módszerrel számítottuk ki, majd semlegesítési log10 MN50 titerként fejeztük ki.

memória B-sejt enzimhez kapcsolt immunospot (ELISpot) vizsgálat

a krio-tartósított Pbmc-ket gyorsan felolvasztottuk egy 37cc-os vízfürdőben. A magzati borjúszérum (FCS) / DNáz (100 ~ g/mL) keverékét lassan adtuk a Pbmc-khez, mielőtt rpmic-be (RPMI/10% FCS/glutamin/antibiotikus koktél). 1 óra után 37cc-nél a Pbmc-ket a viacount Guava készlet segítségével számoltuk a gyártó utasításai szerint. A Pbmc-ket rpmic-et tartalmazó poliklonális stimulációs táptalajban, r848-Cal (resikvimod) rpmic-et tartalmazó poliklonális stimulációs táptalajban reszuszpendáltuk, R8G/mL-rel (resikvimod) és 10 ng/mL-rel (mind a Mabtech-től), majd 37 Kb-n inkubáltuk 5% CO2-vel 4 napig, hogy lehetővé tegyük a memória B-sejtek differenciálódását antitest-szekretáló sejtekké (ASC) 37.

steril 96-kút Multiscreen-IP lemezeket PVDF membránokkal (Millipore) előzetesen inkubáltuk 35 65%-os etanollal, majd háromszor steril PBS 1x-vel mossuk, mielőtt 100 ml anti-IgG humán antitesttel (Mabtech klón 3850-3-1000) bevonnánk az összes IgG szekretáló sejt vagy pre-membrán és boríték (prM / Env) vírusszerű részecskék (VLP) kimutatására ZIKV vagy NS1 ZIKV (the native antigen company, Egyesült Királyság). A lemezeket egy éjszakán át inkubáltuk 4 6CC-n, majd háromszor steril 1x PBS-sel mossuk, majd RPMIc közeggel 2 órán át 37ccc-n át telítjük. Ezután eltávolítottuk az RPMIc táptalajt, és Pbmc-ket adtunk hozzá 2500 és 5000 sejthez az antitesttel bevont capture kutakban, valamint 200 000 és 400 000 sejthez a zikv prM/Env VLP vagy ZIKV NS1 bevonatú kutakban RPMIc táptalajban. Mindegyik állapotot három példányban teszteltük, és a lemezeket 20 órán át inkubáltuk 37cc-n 5% CO2-vel.

a lemezeket kétszer PBS/Tween 20-ban (0,05%) és háromszor PBS-sel mossuk, és biotinilezett anti-humán IgG Ab-vel (MABTECH Clone MT78/145-Biotin, Svédország) inkubáljuk 1 6G/mL PBS /0,5% BSA-val RT-n keresztül 1,5 órán át. A lemezeket öt alkalommal PBS-ben mostuk, majd phycoerythrin-jelölt sztreptavidint (Sigma, Franciaország) 1:100 arányban 0,5% PBS/BSA-val hígítottuk. A lemezeket 1 órán át inkubáltuk RT-n, majd hatszor mossuk PBS-sel, szárítjuk és sötétben tartjuk. A lemezeket a Hlw20 olvasóval (Microvision Instrument) olvasták IRIS szoftver segítségével, majd kozmikus szoftverrel elemezték. Az eredményeket az antigén-specifikus asc-k százalékos arányában fejezzük ki az összes IgG asc között.

T-sejtes ELISpot vizsgálatok

a ZIKV-specifikus T-sejtes immunválaszokat IFNy és IL-5 ELISpot vizsgálatokkal értékelték 15-aminosav (aa) peptidek összesítésével, 11 aa átfedéssel az Env, a prM és a kapszid zikv fehérjéket lefedve (JPT, Németország). Röviden, 96 jól Multiscreen-IP lemezeket PVDF membránokkal (Millipore) előkezeltünk 35%-os etanollal, majd egy éjszakán át 4 ~ C-on 100 ~ ~ /kút majom/humán IFNy-vel (MABTECH klón MT126L) vagy anti-humán IL-5-tel (MABTECH klón TRFK5) 10 ~ g/mL-rel steril PBS 1 ~ – ben. Az RPMIc-kel (Rpmi/10% FCS/glutamin/antibiotikus koktél) történő blokkolást követően 3 db 105 felolvasztott Pbmc-t inkubáltunk három példányban, mindegyik ZIKV peptidből 2 db/mL-rel vagy egy irreleváns peptidkészlettel (negatív kontroll) a Biolegend anti-CD28 (MAB CD28.2) és anti-CD49d (mAb 9F10) jelenlétében, mint társstimulátorok. Pha (Remel)/PMA (SIGMA) stimulációt alkalmaztak pozitív kontrollként. 18 órás inkubációt követően 37cc-n a lemezeket PBS-BSA 0-ban mossuk.5%-ot, és biotinilezett anti-humán IFNy-vel (Mabtech klón 7-B6-1) vagy biotinilezett anti-humán IL-5-tel (Mabtech klón 5A10) inkubálva 1 ~ g/mL-en, 100 ~ l/kút alatt, 2 órán át RT-n, sötétben. Mosás után a lemezeket ezután streptavidin-PE-vel (Southern Biotech) inkubáltuk 1 órán át RT-n, sötétben, majd hat mosás következett PBS-BSA 0,5% – ban.

a lemezeket a Hlw20 olvasóval (Microvision Instrument) olvastuk IRIS szoftver segítségével, majd kozmikus szoftverrel elemeztük. Az eredményeket az IFNy vagy IL-5 foltképző sejtek (SFC) számában fejeztük ki 106 Pbmc-re vonatkoztatva.

statisztikai módszerek

a statisztikai elemzések előtt minden adatot log-transzformáltunk. D0-tól D164-ig a humorális válaszok elemzését a varianciák elemzésének longitudinális modelljével végeztük, minden majomnál különböző időpontokban végzett ismételt mérésekkel. Az időhatást másodfokú effektus segítségével modelleztük. A kihívás és a fellendítő hatások modellezéséhez minden kiolvasáshoz egy longitudinális varianciaanalízist használtunk. Minden majom esetében a modellben figyelembe vették a különböző időpontokban végzett ismételt méréseket. Tukey vagy Dunnett kiigazításokat végeztünk több összehasonlítást.

a sejtek által közvetített immunitás szempontjából a csoportok vagy az időpontok összehasonlítását egyirányú ANOVA-val vagy a biológiai kérdéstől függően longitudinális modell alkalmazásával végeztük.

az összes analízist SAS 6.4-es verziójú szoftverrel végeztük, 0,05-ös alfa szinten. Az ennél alacsonyabb P-értékek statisztikailag szignifikáns különbségeket jeleztek.

etikai megfontolások

minden állatkísérletet az Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care Akkreditált állatellátó létesítmények, a 2010/63 / EK európai irányelvnek és a francia nemzeti előírásoknak megfelelően végeztek. A protokollokat a Sanofi Pasteur állatkísérletek Etikai Bizottsága hagyta jóvá.

a kihívásos vizsgálatban használt makákókat a vizsgálat végén (4 hónappal a kihívás után) humánus módon eutanizálták biológiai biztonsági okokból, mivel a ZIKV-ről beszámoltak, hogy alkalmanként tartós a makákókban30. Az emlékeztető vizsgálathoz használt állatokat más kutatási kísérletekben újra felhasználták.

jelentés összefoglaló

a kutatási tervezéssel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.