Un vaccino Zika inattivato purificato ottimizzato fornisce immunogenicità e protezione sostenute nei vaccini cynomolgus macachi

Formulazioni vaccinali ZPIV e ZPIV-SP

Il candidato ZPIV (fase-I lotto clinico) è stato fornito da WRAIR16. Il vaccino è stato fornito in forma liquida, pronto per l’iniezione, a 5 µg di proteine per dose (500 µL), corrispondenti a 200 unità antigeniche (AU), formulate con AlOOH. Il vaccino ottimizzato (ZPIV-SP) è stato preparato a Sanofi Pasteur (Marcy l’Etoile, Francia) utilizzando il processo WRAIR come punto di partenza con i seguenti miglioramenti. In breve, dopo l’amplificazione iniziale di ZIKV-PR nelle cellule di Sanofi Pasteur Vero, l’RNA virale è stato estratto e trasfettato nelle cellule di Sanofi Pasteur serum-free (SPSF) Vero. Il virus recuperato è stato amplificato, placca-purificato due volte ed ulteriormente amplificato per generare un lotto del seme del pre-padrone da cui un padrone ed un lotto del seme di lavoro sono stati derivati. Il virus è stato prodotto in un bioreattore da 180 L utilizzando cellule SPSF Vero. Il virus è stato quindi chiarito, purificato mediante ultracentrifugazione con un taglio modificato e cromatografia e inattivato mediante trattamento con formalina. I parametri delle fasi di purificazione e inattivazione sono stati ottimizzati rispetto alle condizioni utilizzate da WRAIR. Il prodotto medicinale è stato regolato per il contenuto antigenico della busta ZIKV (E) mediante ELISA a 400 AU/mL (corrispondente a 10 µg/mL di proteine ZPIV) e liofilizzato. Il vaccino liofilizzato è stato aggiustato a 100, 200 o 400 UA per dose (500 µL) e risospeso in un gel AlOOH (500 µg/dose—Brenntag Biosector, Danimarca). AU è stato definito come il contenuto antigenico Env (envelope) misurato mediante ELISA.

programma di Vaccinazione

Quattro gruppi di sei flavivirus negativo maschio cynomolgus macachi (Macaca fascicularis – Noveprim), di età compresa tra 2 anni, ha ricevuto 500 µL di prima generazione ZPIV (gruppo A: 200 AU) o ottimizzato ZPIV-SP (gruppo B: 100 AU, gruppo C: 200 AU o gruppo D: 400 AU) per via intramuscolare (IM), in il diritto del quadricipite giorno 0 (D0) e nel quadricipite sulla D28. Sei mesi dopo (D176), i sei macachi del gruppo B che avevano ricevuto 100 UA di ZPIV-SP, hanno ricevuto una dose di richiamo della stessa formulazione e sono stati seguiti per 6 mesi (Fig. 1). Gli altri gruppi sono stati utilizzati per la sfida virale.

Monitoraggio clinico

Sono state osservate reazioni immediate entro 30 minuti e potenziali reazioni locali nel sito di iniezione nei 7 giorni successivi ad ogni immunizzazione. I macachi sono stati monitorati ogni giorno e durante lo studio sono stati registrati sintomi come diminuzione dell’assunzione di cibo, mobilità limitata, polipnea, reazioni locali e sistemiche. Il peso corporeo e la temperatura corporea (utilizzando chip transponder) sono stati registrati al basale e ad intervalli regolari durante tutto lo studio.

prelievo di Sangue post-immunizzazione per l’immunogenicità di valutazione

Sieri sono stati raccolti in punti differenti di tempo superiore a 6 mesi post-dose 1 e 2 (da D0 a D164) e post-boost per il gruppo B (D15 a D170) per valutare le risposte umorali, tra cui ZIKV anticorpi neutralizzanti da un MN50 dosaggio e ZIKV Env e NS1-specifici IgG ELISA.

Le PBMC sono state raccolte al basale, D7, D35, D90 e D164 per valutare l’immunità cellulo-mediata e le risposte delle cellule B della memoria.

la Sfida con il wild-type ZIKV-PR

Cinque mesi post-dose 2 (D176), i macachi, gruppi a, C, D, e sei ingenuo macachi (gruppo E: controllo sham), si sono sfidati con 105 unità formanti placca (PFU diluito in tampone fosfato salino (PBS)) di wt-ZIKV-PR (ceppo PRVABC59 dal CDC) da via sottocutanea (SC) iniezione nella regione deltoidea del braccio destro e sotto anestesia (Zoletil®) (Fig. 1). La dose di sfida e la via sono state selezionate sulla base dei risultati di uno studio precedente (risultati non pubblicati).

Campionamenti biologici post-challenge

Il plasma è stato raccolto ogni giorno per 7 giorni e su D9 e D15 post-challenge per i test virologici. CSF (100-300 µL) è stato raccolto dalla cisterna magna su D7, D15 e D28 post-sfida. L’assenza di contaminazione del sangue nel liquido cerebrospinale è stata confermata attraverso l’ispezione visiva e i campioni sono stati conservati a -80 °C. La saliva è stata raccolta ogni giorno per 15 giorni e i liquidi oculari sono stati raccolti con un tampone su D7 e D15 post-challenge. I tamponi sono stati posti in provette contenenti 500 µL di RNA in seguito (Invitrogen, USA) e sono stati miscelati tramite vortex. I tamponi sono stati poi scartati e gli eluati sono stati conservati a -80 °C fino all’analisi.

Per i test immunologici il plasma è stato raccolto in più punti temporali da D15 a D112 e i PBMC sono stati raccolti su D35 e D112.

Viremia e carica virale nei fluidi biologici post-challenge

L’RNA ZIKV nel plasma, nella saliva, nel liquido oculare e nei campioni di liquido cerebrospinale dei gruppi A, C, D ed E è stato quantificato post-challenge utilizzando una QRT-PCR mirata al gene NS522. L’RNA genomico totale è stato estratto per la prima volta da campioni con un kit virus Macherey Nagel NucleoSpin® 96 (Macherey Nagel, Germania) su una workstation di estrazione dell’RNA automatizzata Tecan Evoware secondo le istruzioni del produttore ed eluito in acqua priva di nucleasi.

ELISA a sandwich per quantificare l’antigene ZIKV NS1

Il contenuto residuo di antigene ZIKV NS1 è stato quantificato da un ELISA a sandwich nella preparazione virale utilizzata per il challenge. È stato anche misurato in non diluito e diluito (1:30) campioni di plasma raccolti al basale, D1, D2, D3, D4 e D5 da tutti i gruppi sfidati come metodo indiretto per valutare la replicazione virale.

In breve, le piastre ELISA a 96 pozzetti sono state rivestite con un anticorpo monoclonale di topo specifico per la proteina ZIKV NS1 (clone B-J5 R&D Biotech, Francia) in soluzione salina tamponata con fosfato 1 × (PBS). I siti non legati sono stati quindi bloccati per 1 ora a 37 °C con PBS-Tween20 in latte all ‘ 1% (PBS-Tw-M). Le piastre sono state lavate con PBS-Tween20 tra le fasi di incubazione. I campioni di prova sono stati diluito serialmente duplice in PBS-Tw-M e incubate in pozzi per 1 h a 37 °C. Un secondo mouse anticorpo monoclonale anti perossidasi di rafano (HRP)-coniugato diretto a ZIKV proteina NS1 (clone B-M6 R&D Biotech, Francia) è stato aggiunto e incubate per 90 min a 37 °C. Successivamente, le piastre sono state incubate al buio per 45 min a temperatura ambiente (RT) con un pronto per l’uso Tetrametilbenzidina (Tebu-Bio Laboratori, France) il substrato. Le reazioni sono state interrotte con 1 N HCl (VWR Prolabo). La densità ottica (OD) è stata misurata a 450-650 nm con un lettore automatico di lastre. Una proteina ricombinante ZIKV NS1 (antigene nativo, UK) è stata utilizzata per stabilire una curva standard per determinare il contenuto di NS1 dei campioni di prova. La concentrazione proteica è stata determinata come media di tutte le concentrazioni individuali per l’intervallo di valori OD da 0,2 a 3,0. Il limite di rilevazione (LOD) del test era di 5 ng/mL.

I test immunologici

Envelope specifici per busta e NS1

Envelope specifici per busta e NS1 sono stati valutati mediante ELISA in piastre a 96 pozzetti rivestite con proteina E ricombinante (Meridian Life Science Inc., Memphis, USA) o proteina ricombinante non strutturale 1 (NS1) proteina (Native Antigen Company, Oxford, UK) in tampone carbonato, pH 9.6. Dopo il blocco con PBS-Tween20-milk per 60 min a 37 °C, sono stati aggiunti due campioni di siero diluito e incubati per 90 min a 37 °C. Le fasi di lavaggio sono state eseguite tra le fasi di incubazione con PBS-Tween. Un IgG HRP-coniugato di capra anti-scimmia (Ref AAI42P, BIO-RAD, Francia) diluito in PBS-Tw-M a 1:5000 è stato aggiunto e incubato per altri 90 min a 37 °C prima dello sviluppo del colore con substrato di tetrametilbenzidina (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, Francia). La densità ottica è stata misurata a 450-650 nm con un lettore automatico di lastre. I titoli per I specifici per E sono stati calcolati utilizzando una curva di regressione del siero di riferimento della scimmia anti-ZIKV. I titoli per NSs NS1-specifici sono stati calcolati come la diluizione reciproca del siero dando una densità ottica di 1 utilizzando la funzione di tendenza. Il titolo del riferimento è stato precedentemente calcolato come la media di diverse determinazioni della diluizione reciproca che danno una densità ottica di 1,0. Tutti i titoli sono stati espressi in unità log10 ELISA (EU). Il LOD è stato impostato su 1.3 log10 EU e un titolo arbitrario di 1.0 log10 è stato assegnato a ciascun titolo sotto il LOD.

Anticorpi neutralizzanti ZIKV

È stato utilizzato un test ZIKV MN50 ad alto rendimento per misurare gli anticorpi neutralizzanti ZIKV specifici22. In breve, i sieri inattivati dal calore sono stati diluiti in serie, miscelati con ZIKV-PR e incubati a 37 °C per 75 min. Le miscele sono state quindi trasferite su piastre a 96 pozzetti contenenti monostrati confluenti di cellule Vero. Dopo incubazione per 5 giorni, le cellule infette sono state colorate con pan-flavivirus biotinilato 4G2 mAb (HB112, Biotem, Francia) e visualizzate con 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/tetrazolio blu nitro nel substrato di levamisolo. I pozzetti positivi sono stati definiti come almeno un focus infettivo colorato rilevato. Per ogni diluizione, è stato registrato il numero totale di pozzetti negativi e la diluizione reciproca corrispondente al 50% della neutralizzazione virale è stata calcolata utilizzando il metodo del minimo quadrato ed espressa come titolo log10 MN50 di neutralizzazione.

Test di immunospot (ELISpot) legato agli enzimi a cellule B di memoria

I PBMC crio-conservati sono stati rapidamente scongelati in un bagno d’acqua a 37 °C. Una miscela di siero di vitello fetale (FCS) / DNasi (100 µg/mL) è stata aggiunta lentamente ai PBMC, prima di essere trasferita a RPMIc (RPMI/10% FCS/glutammina/cocktail antibiotico). Dopo 1 ora a 37 °C, le PBMC sono state contate utilizzando il kit ViaCount Guava secondo le istruzioni del produttore. I PBMC sono stati risospesi a 1 × 106 cellule / mL in mezzo di stimolazione policlonale contenente RPMIc con R848 (resiquimod) a 1 µg/mL e IL-2 a 10 ng/mL (entrambi da Mabtech) e incubati a 37 °C con il 5% di CO2 per 4 giorni per consentire la differenziazione delle cellule B della memoria in cellule secernenti anticorpi (ASC)37.

Le piastre sterili Multiscreen-IP a 96 pozzetti con membrane PVDF (millipore) sono state pre-incubate con 35 µL di etanolo al 35%, quindi lavate tre volte con PBS 1X sterile prima di essere rivestite con 100 µL di un anticorpo umano anti-IgG (Mabtech clone 3850-3-1000) per rilevare le cellule secernenti IgG totali o particelle simili al virus (VLP) ZIKV o NS1 ZIKV (La Native Antigen Company, Regno Unito). Le piastre sono state incubate durante la notte a 4 °C e poi lavate tre volte con 1x PBS sterile e saturate con mezzo RPMIc per 2 h a 37 °C. Il mezzo RPMIc è stato quindi rimosso e i PBMC sono stati aggiunti a 2500 e 5000 cellule nei pozzetti di cattura rivestiti di anticorpi e a 200.000 e 400.000 cellule nei pozzetti rivestiti di ZIKV prM/Env VLP o ZIKV NS1, nel mezzo RPMIc. Ogni condizione è stata testata in triplice copia e le piastre sono state incubate per 20 h a 37 °C con il 5% di CO2.

Le piastre sono state lavate due volte in PBS/Tween 20 (0,05%) e tre volte con PBS e incubate con un IgG Ab anti-umano biotinilato (clone Mabtech MT78/145-Biotina, Svezia) a 1 µg /mL in PBS 1 × / 0,5% BSA a RT per 1,5 ore. Le piastre sono state ulteriormente lavate cinque volte in PBS e la streptavidina marcata con ficoeritrina (Sigma, Francia) diluita 1:100 con 0,5% PBS/BSA è stata aggiunta. Le piastre sono state incubate per 1 h a RT, quindi lavate sei volte con PBS, asciugate e tenute al buio. Le lastre sono state lette con il lettore HLW20 (Microvision Instrument) utilizzando il software IRIS e analizzate con il software Cosmic. I risultati sono espressi come percentuale di ASCs antigene-specifici tra ASCs IgG totali.

Test ELISpot a cellule T

Le risposte immunitarie a cellule T specifiche di ZIKV sono state valutate da test IFNy e IL-5 ELISpot utilizzando pool di peptidi 15-amminoacido (aa) con sovrapposizioni di 11 aa che coprono le proteine Env, prM e Capsid ZIKV (JPT, Germania). In breve, le piastre Multiscreen-IP a 96 pozzetti con membrane PVDF (millipore) sono state pretrattate con etanolo al 35%, quindi rivestite durante la notte a 4 °C con 100 µL/pozzetto di anti-scimmia/IFNy umano (Mabtech clone MT126L) o anti-umano IL-5 (Mabtech clone TRFK5) a 10 µg/mL in PBS sterile 1×. Dopo il blocco con RPMIC (RPMI/10% FCS/Glutammina / cocktail antibiotico), 3 × 105 PBMC scongelati sono stati incubati in triplice copia con 2 µg / mL di ciascun peptide ZIKV o un pool di peptidi irrilevante (controllo negativo) in presenza di anti-CD28 (Mab CD28.2) e anti-CD49d (Mab 9F10) di Biolegend come co-stimolatori. La stimolazione PHA (Remel)/PMA (SIGMA) è stata utilizzata come controllo positivo. Dopo un’incubazione di 18 ore a 37 °C, le piastre sono state lavate in PBS-BSA 0.5% e incubato con biotinilato anti-umano IFNy (Mabtech clone 7-B6-1) o biotinilato anti-umano IL-5 (Mabtech clone 5A10) a 1 µg/mL, sotto 100 µL/bene, per 2 h a RT, al buio. Dopo il lavaggio, le piastre sono state successivamente incubate con streptavidina-PE (Southern Biotech) per 1 h a RT, al buio seguito da sei lavaggi in PBS-BSA 0,5%.

Le lastre sono state lette con il lettore HLW20 (Microvision Instrument) utilizzando il software IRIS e analizzate con il software Cosmic. I risultati sono stati espressi come il numero di cellule che formano punti IFNy o IL-5 (SFC) per 106 PBMC.

Metodi statistici

Tutti i dati sono stati log-trasformati prima delle analisi statistiche. Da D0 a D164, le analisi delle risposte umorali sono state eseguite utilizzando un modello longitudinale di analisi delle varianze con misurazioni ripetute in diversi punti temporali per ogni scimmia. L’effetto tempo è stato modellato utilizzando un effetto quadratico. Per modellare gli effetti challenge e boost, è stato utilizzato un modello longitudinale di analisi della varianza per ogni lettura. Per ogni scimmia, nel modello sono state prese in considerazione misurazioni ripetute in diversi punti temporali. Tukey o Dunnett aggiustamenti sono stati eseguiti per confronti multipli.

Per l’immunità cellulo-mediata, i confronti tra gruppi o punti temporali sono stati effettuati da un ANOVA a senso unico o utilizzando un modello longitudinale a seconda della domanda biologica.

Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando il software SAS® v9.4 ad un livello alfa di 0,05. Valori P inferiori a questo valore indicavano differenze statisticamente significative.

Considerazioni etiche

Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità con l’Associazione per la valutazione e l’accreditamento delle strutture animali accreditate per la cura degli animali da laboratorio, in conformità alla Direttiva Europea 2010/63 e alle normative nazionali francesi. I protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico Sanofi Pasteur per la Sperimentazione Animale.

I macachi utilizzati nello studio challenge sono stati sottoposti a eutanasia umana alla fine dello studio (4 mesi dopo il challenge) per motivi di biosicurezza, poiché è stato riportato che ZIKV è occasionalmente persistente nei macachi30. Gli animali utilizzati per lo studio di richiamo sono stati riutilizzati in altri esperimenti di ricerca.

Reporting summary

Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.

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