Virus Keystone isolato da un adolescente della Florida con rash e febbre soggettiva: un altro Arbovirus endemico nel sud-est degli Stati Uniti?

Abstract

Il virus Keystone, un orthobunyavirus del sierogruppo della California, fu isolato per la prima volta nel 1964 dalle zanzare a Keystone, in Florida. Non ci sono state precedenti segnalazioni di isolamento dagli esseri umani, nonostante gli studi suggeriscano che ~20% delle persone che vivono nella regione sono sieropositive. Segnaliamo l’isolamento del virus da un adolescente della Florida con un’eruzione cutanea e febbre.

L’emergere del virus Zika (ZIKV) e la continua identificazione delle infezioni da virus Chikungunya e da virus Dengue hanno generato crescenti preoccupazioni per l’endemicità e la diffusione degli arbovirus negli Stati Uniti. Keystone virus (KEYV; genere Orthobunyavirus, famiglia Peribunyaviridae), un membro del sierogruppo orthobunyavirus California, è stato isolato dalle zanzare in Keystone, Florida (vicino a Tampa Bay), nel 1964 . Studi successivi hanno dimostrato un’ampia distribuzione del virus nelle zanzare, in particolare Aedes atlanticus, così come in scoiattoli, procioni e cervi dalla coda bianca, nelle regioni costiere che si estendono dalla baia di Chesapeake verso sud attraverso la Florida e fino al Texas .

In studi condotti su popolazioni umane negli anni ‘ 60, i tassi di sieropositività erano nell’intervallo del 19-21% . Tuttavia, l’isolamento effettivo di KEYV dall’uomo non è mai stato riportato prima, né KEYV è stato collegato a una sindrome clinica nell’uomo, nonostante la sua apparente endemicità negli animali e nelle zanzare.

CASE REPORT

Un maschio di 16 anni precedentemente sano presentato in agosto, 2016, in una clinica di cure urgenti nella Florida centro-settentrionale con una storia di febbre di basso grado e un’eruzione cutanea diffusa. Il paziente ha riferito di sentirsi “caldo” la sera prima, con una temperatura stimata dai suoi genitori nell’intervallo di ~100°F. Una eruzione papulare eritematosa apparve la mattina della presentazione, iniziando sul petto e diffondendosi progressivamente all’addome, al braccio, alla schiena e al viso. Non c’erano vescicole e l’eruzione era indolore e non pruriginosa. Era aggravato dal calore e dalla luce solare. Il paziente ha negato brividi, mal di testa, rigidità del collo o sintomi gastrointestinali. Ha fatto notare lieve affaticamento e fastidio alla caviglia, che ha attribuito alla partecipazione concomitante ad un campo estivo per i partecipanti marching band, indossando nuove scarpe band. La settimana precedente, il paziente era stato diagnosticato con possibile tonsillite ed era stato posto in terapia con amoxicillina a 500 mg assunto per via orale 3 volte al giorno, che aveva auto-interrotto il giorno successivo. Non aveva alcuna storia medica o chirurgica precedente; nessuna condizione immunosoppressiva o congenita nota; nessuna allergia nota; nessun viaggio recente al di fuori della Florida centrale; e nessuna esposizione a fattorie o animali da fattoria. Aveva ricevuto tutte le vaccinazioni infantili raccomandate. Nessun altro membro della famiglia era malato. Il paziente e la sua famiglia si erano trasferiti in Florida dal Kansas (dove il virus Keystone non è stato identificato) 4 anni prima della malattia riportata. Il campo band che stava frequentando continuato fino alla sera, e ha riferito di essere stato morso numerose volte dalle zanzare, nonostante l’applicazione di dietiltoluamide (comunemente noto come DEET).

All’esame in clinica, aveva una temperatura di 98,5°F (36,9°C), polso di 69 battiti/minuto, frequenza respiratoria di 12 respiri/minuto e pressione sanguigna di 122/82 mm / Hg. È stata notata un’eruzione diffusa, eritematosa, papulare del tronco, del braccio e del viso (Figura 1). Gli esami della testa, del collo, delle vie respiratorie, cardiovascolari e addominali del paziente erano normali. Un test Monospot rapido eseguito presso la clinica è risultato negativo. Con il consenso del paziente e dei suoi genitori, sono stati raccolti campioni di saliva e urina. L’eruzione si è risolta 2 giorni dopo, senza ulteriori febbre. Successivamente ha assunto amoxicillina senza comparsa di eruzione cutanea.

Figura 1.

Eruzione cutanea osservata in pazienti di 16 anni.

Figura 1.

Eruzione cutanea osservata in pazienti di 16 anni.

VIRALE l’IDENTIFICAZIONE/ISOLAMENTO

Trascrizione Inversa Reazione a Catena della Polimerasi Schermi

Come il paziente ha presentato con una storia di eruzioni cutanee e febbre durante il periodo in cui un ZIKV focolaio è stato che si verificano in Florida, saliva e urine campioni sono stati testati e sono risultati negativi per ZIKV, il virus Chikungunya e Dengue virus sierotipo 1-4 genomica acido ribonucleico (RNA) da trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) . La possibilità di un’eziologia di alphavirus o flavivirus è stata ulteriormente valutata eseguendo RT-PCR utilizzando primer universali che rilevano alphavirus e flavivirus in Brasile . Sia i campioni di saliva che di urina sono risultati negativi per alphavirus e flavivirus VRNA, mentre i controlli positivi hanno funzionato come previsto (dati non mostrati).

Trascrizione inversa imparziale Reazione a catena della polimerasi e sequenziamento per l’identificazione del presunto agente eziologico virale

Un’identità di virus presuntiva è stata ottenuta a seguito di una modifica di una procedura che abbiamo precedentemente delineato ; le modalità dettagliate sono fornite nei Dati supplementari che accompagnano questo documento. L’RNA genomico virale (e / o l’acido desossiribonucleico ) è stato estratto dai virioni utilizzando un mini kit di RNA virale QIAamp (Qiagen Inc.). Gli ampliconi PCR sono stati purificati (Qiagen QIAquick PCR purification kit) e A-tailed con Taq DNA polimerasi (New England Biolabs). Gli ampliconi PCR a coda sono stati poi TA-clonati, e gli inserti sequenziati utilizzando Sanger sequenziamento. Su un totale di plasmidi 40 con inserti TA-clonati (inserti 20 da urina, 20 da saliva), 1 da urina conteneva un inserto 166-bp con un’identità del 99% di sequenze del genoma del virus Keystone depositate con GenBank (KT630293.1, U12801.1 e KT630290.1).

Sequenziamento diretto del virus Keystone nelle urine

Poiché vi sono numerosi orthobunyavirus e i primer RT-PCR pubblicati per il sequenziamento KEYV non erano disponibili, il virus è stato sequenziato utilizzando primer appositamente progettati basati su 3 genomi di virus Keystone disponibili e completi in GenBank. Il sequenziamento è stato realizzato utilizzando una strategia di genome-walking, con i primer PCR descritti nella tabella supplementare 1; i nostri metodi completi sono inclusi nei dati supplementari. La sequenza è stata designata come KEYV / Homo sapiens / Gainesville-1/2016; le sequenze del segmento del genoma 3 sono state depositate in GenBank sotto i numeri di adesione MH016784 (segmento grande), MH016785 (segmento medio) e MH016786 (segmento piccolo). La sequenza completa del genoma di L ha 98-99% identità con i genomi corrispondenti dell’unico 3 altre sequenze complete del virus di Keystone L disponibili in Genbank (KT630288.1, KX817321. 1 e KT630291.1). Similmente, il genoma completo di M ha 98-99% in comune con le sequenze corrispondenti di M (AF123489.1, KT630289.1 e KX817322.1) e 99% in comune con le sequenze corrispondenti del genoma di S (KT630293.1, U12801.1 e KT630290.1).

Isolamento e visualizzazione del virus Keystone in cellule coltivate

Poiché il virus Keystone vRNA è stato rilevato mediante sequenziamento imparziale( e successivamente è stato completamente sequenziato), sono stati fatti tentativi per isolare il virus in una linea cellulare nota per supportare la sua crescita (cellule Vero) e nella linea cellulare del neuroblastoma di topo Neuro-2A; una descrizione dei metodi completi è fornita nei Dati supplementari. Effetti citopatici misti indotti dal virus (CPE) sono stati evidenti nelle cellule Neuro-2A entro 2 giorni dall’inoculazione delle cellule con l’urina, ma non con la saliva, e lo stesso è stato osservato 1 giorno dopo nelle cellule Vero E6. Al momento della sottocultura, CPE erano evidenti 2 giorni dopo l’inoculazione di cellule Vero E6 con mezzi spesi da Neuro-2A inoculato con urina. Il CPE indotto da KEYV formato nelle cellule Vero E6 è raffigurato nelle figure supplementari S1A e S1B; entrambe le cellule originali Vero E6 inoculate con urina e Vero E6 inoculate con cellule Neuro-2A infette da virus hanno formato lo stesso tipo di CPE. I supernatanti delle cellule infettate dal virus sono risultati positivi per KEYV vRNA mediante RT-PCR, mentre quelli dei controlli mock-inoculati sono risultati negativi per KEYV vRNA.

Per dimostrare la replicazione attiva del virus Keystone, le cellule Vero E6 che mostrano CPE significativo (> 70% del monostrato di cellule infette) 40 ore dopo l’infezione sono state analizzate mediante microscopia elettronica a trasmissione e hanno dimostrato di dimostrare il tipico CPE indotto dal bunyavirus e la produzione di virioni progenie. I metodi e le immagini (Figure supplementari S2A-F) sono inclusi nei Dati supplementari.

COMMENTO

KEYV, un virus a RNA a singolo filamento negativo, è generalmente inserito in quello che è stato definito il “Sierogruppo della California” del genere Orthobunyavirus, che include, tra gli altri, il virus dell’encefalite della California, il virus del Jamestown Canyon e il virus dell’encefalite di La Crosse. KEYV, sulla base di studi condotti negli anni ’60 e’ 70, sembra essere diffuso nelle zone costiere del sud-est degli Stati Uniti, con isolati identificati (in campioni di zanzare e animali) dalla baia di Chesapeake al Texas. L’organismo sembra avere un numero di ospiti vertebrati, tra cui, come precedentemente osservato, il grigio scoiattolo (30% di sieropositività in uno studio condotto in Pokomoke Cypress Swamp nel Maryland ), procioni (18% sieropositivi nello stesso studio), e whitetailed cervi (10% di sieropositivi nel Maryland studio; 2% sieropositivi in uno studio in Texas ); appare essere rare di uccelli o rettili popolazioni. Il virus può essere trasmesso transovarialmente nelle zanzare, con A. atlanticus che sembra essere un vettore primario (sebbene KEYV sia stato identificato in altre specie Aedes e Culex ). Il quadro che emerge è quello di un virus endemico delle zanzare e dei vertebrati forestali, anche se di incerta rilevanza clinica nelle popolazioni animali.

C’è, quindi, la questione della rilevanza di KEYV per gli esseri umani. Gli studi di sieroprevalenza condotti 50 anni fa utilizzando saggi di neutralizzazione virale hanno suggerito che la sieropositività in popolazioni umane sane era nell’intervallo del 20%. I nostri dati hanno dimostrato che le infezioni umane possono (e lo fanno ancora) verificarsi, con virus vitale rilevabile nelle urine. Mentre non possiamo dire con certezza che il virus è stato responsabile per l ” eruzione cutanea e febbre segnalati, i nostri dati sono chiaramente suggestivi, e aumentare la possibilità che una percentuale di ciò che sono altrimenti insignificanti casi di rash e febbre visto in ambienti di assistenza primaria nelle zone costiere del sud-est degli Stati Uniti in realtà riflettere infezioni KEYV. Molti dei virus nel gruppo della California sono stati collegati con l’encefalite e, come dimostrato in questo rapporto, il virus cresce bene nelle linee cellulari del neuroblastoma; nei casi di encefalite virale in cui non viene determinata alcuna eziologia, può anche essere utile cercare infezioni da KEYV. Nel caso attuale, nel contesto delle preoccupazioni per un’infezione da ZIKV, una valutazione virologica completa ha portato all’isolamento del virus; è altamente improbabile che, al di fuori di un ambiente di ricerca simile, sarebbe mai stato identificato. I nostri risultati sottolineano la diversità dei potenziali patogeni arbovirali in questa regione e suggeriscono che un’analisi completa dei possibili patogeni virali dovrebbe includere la diagnostica per KEYV.

Dati supplementari

I materiali supplementari sono disponibili su Clinical Infectious Diseases online. Costituiti da dati forniti dagli autori a beneficio del lettore, i materiali pubblicati non sono copiati e sono di esclusiva responsabilità degli autori, quindi domande o commenti devono essere indirizzati all’autore corrispondente.

Note

Sostegno finanziario. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti interni dell’Università della Florida Emerging Pathogens Institute e del Dipartimento di salute ambientale e globale, College of Public Health and Health Professions.

Potenziali conflitti di interesse. Tutti gli autori: Nessun conflitto di interessi segnalato. Tutti gli autori hanno presentato il modulo ICMJE per la divulgazione di potenziali conflitti di interesse. I conflitti che gli editori considerano rilevanti per il contenuto del manoscritto sono stati divulgati.

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© L’autore(i) 2018. Pubblicato da Oxford University Press per la Infectious Diseases Society of America. Tutti i diritti riservati. Per le autorizzazioni, e-mail: [email protected]
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