Een optimaal gezuiverd geïnactiveerd Zika vaccin biedt aanhoudende immunogeniciteit en bescherming in cynomolgus apen

ZPIV en ZPIV-SP-vaccin formuleringen

De ZPIV kandidaat (fase I klinische batch) werd verstrekt door WRAIR16. Het vaccin werd geleverd in vloeibare vorm, klaar voor injectie, met 5 µg eiwitten per dosis (500 µL), overeenkomend met 200 antigene eenheden (AE), geformuleerd met AlOOH. Het geoptimaliseerde vaccin (ZPIV-SP) werd bereid bij Sanofi Pasteur (Marcy l ‘ Etoile, Frankrijk) met behulp van het WRAIR-proces als uitgangspunt met de volgende verbeteringen. Kort na de initiële versterking van Zikv-PR in VERO-cellen van Sanofi Pasteur werd viraal RNA geëxtraheerd en getransfecteerd in de serumvrije (SPSF) Vero-cellen van Sanofi Pasteur. Herstelde virus werd versterkt, plaque-gezuiverd tweemaal en verder versterkt om een pre-Master zaad Lot waaruit een meester en een werkende zaad Lot werden afgeleid genereren. Het virus werd geproduceerd in een 180 L bioreactor met behulp van Spsf Vero cellen. Het virus werd vervolgens geklaard, gezuiverd door ultracentrifugatie met een gemodificeerde cut-off en chromatografie, en geïnactiveerd door formalinebehandeling. De parameters van de zuiverings-en inactivatiestappen werden geoptimaliseerd vergeleken met de voorwaarden die door WRAIR worden gebruikt. Het geneesmiddel werd aangepast voor zikv envelop (E) antigene inhoud door ELISA tot 400 ae/mL (overeenkomend met 10 µg/mL zPIV eiwitten) en gevriesdroogd. Het gevriesdroogde vaccin werd aangepast tot 100, 200 of 400 ae per dosis (500 µL) en geresuspendeerd in een AlOOH gel (500 µg/dosis—Brenntag Biosector, Denemarken). GE werd gedefinieerd als het envelop (env) antigene gehalte gemeten met ELISA.

vaccinatieschema

vier groepen van zes flavivirus-negatieve mannelijke cynomolgusapen (Macaca fascicularis – Noveprim), 2 jaar oud, kregen 500 µL eerste generatie ZPIV (Groep A: 200 ae) of geoptimaliseerde ZPIV-SP (groep B: 100 ae, Groep C: 200 ae of groep D: 400 ae) intramusculair (IM) in de rechter quadriceps op dag 0 (D0) en in de linker quadriceps op dag 0 (D0). D28. Zes maanden later (D176) kregen de zes makaken in groep B die 100 ae ZPIV-SP hadden ontvangen, een boosterdosis van dezelfde formulering en werden gedurende 6 maanden gevolgd (Fig. 1). De andere groepen werden gebruikt voor de virale uitdaging.

klinische controle

onmiddellijke reacties werden binnen 30 minuten waargenomen en potentiële lokale reacties op de injectieplaats werden waargenomen gedurende de 7 dagen na elke immunisatie. De makaken werden elke dag gecontroleerd en symptomen zoals verminderde voedselinname, beperkte mobiliteit, polypneu, lokale en systemische reacties werden gedurende het hele onderzoek geregistreerd. Lichaamsgewicht en lichaamstemperatuur (met behulp van transponderchips) werden bij aanvang en met regelmatige tussenpozen gedurende het onderzoek geregistreerd.

bloedafname post-immunisatie voor immunogeniciteit beoordeling

Sera werden verzameld op verschillende tijdstippen gedurende 6 maanden post-dosis 1 en 2 (D0 te D164) en post-boost voor groep B (D15 naar D170) beoordelen van humorale reacties, met inbegrip van ZIKV neutraliserende antilichamen door een MN50 gehalte en ZIKV Env en NS1-specifieke IgG door ELISA.

PBMC ‘ s werden verzameld bij baseline, D7, D35, D90 en D164 om cellulaire gemedieerde immuniteit en B-celresponsen in het geheugen te beoordelen.

Challenge met wild-type ZIKV-PR

vijf maanden na dosis 2 (D176) werden de makaken in de groepen A, C, D en zes naïeve makaken (Groep E: sham control) uitgedaagd met 105 plaquevormende eenheden (PFU verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)) van wt-ZIKV-PR (stam PRVABC59 van CDC) door subcutane (SC) injectie in de deltoïde regio van de rechterarm en onder verdoving (zoletil®) (fig. 1). De challenge dosis en route werden geselecteerd op basis van resultaten van een eerdere studie (niet-gepubliceerde resultaten).

biologische monsternemingen post-challenge

Plasma werd elke dag verzameld gedurende 7 dagen en op D9 en D15 post-challenge voor virologische assays. CSF (100-300 µL) werd verzameld uit de cisterna magna op D7, D15 en D28 post-challenge. De afwezigheid van bloedcontaminatie in de liquor werd bevestigd door visuele inspectie en monsters werden bewaard bij -80 °C. speeksel werd elke dag gedurende 15 dagen verzameld en oculaire vloeistoffen werden verzameld met een uitstrijkje op D7 en D15 post-challenge. De swabs werden later geplaatst in buisjes die 500 µL RNA bevatten (Invitrogen, USA) en werden gemengd door vortexing. De swabs werden vervolgens weggegooid en eluaten werden bewaard bij -80 °C tot geanalyseerd.

voor immunologische assays werd plasma verzameld op meerdere tijdstippen van D15 tot D112 en werden PBMC ‘ s verzameld op D35 en D112.

viremie en virale belasting in biologische vloeistoffen post-challenge

ZIKV RNA in plasma, speeksel, oculaire vloeistof en CSF monsters van groepen A, C, D en E werden na de challenge gekwantificeerd met behulp van een qRT-PCR gericht op de NS5 gene22. Total genomic RNA werd eerst geëxtraheerd uit monsters met een Macherey Nagel NucleoSpin® 96 virus kit (Macherey Nagel, Duitsland) op een Tecan evoware geautomatiseerde RNA-extractie werkstation volgens de instructies van de fabrikant en geëlueerd in nucleasevrij water.

Sandwich-ELISA om ZIKV NS1-antigeen te kwantificeren

residueel ZIKV NS1-antigeengehalte werd gekwantificeerd met een sandwich-ELISA in het viruspreparaat dat werd gebruikt voor challenge. Het werd ook gemeten in onverdund en verdund (1:30) plasmamonsters verzameld bij baseline, D1, D2, D3, D4 en D5 van alle Challenge-groepen als een indirecte methode om virale replicatie te beoordelen.

kort werden 96-wells ELISA-platen gecoat met een muis monoklonaal antilichaam specifiek voor het zikv NS1-eiwit (kloon B-J5 R&d Biotech, Frankrijk) in fosfaatgebufferde zoutoplossing 1 × (PBS). Ongebonden locaties werden vervolgens gedurende 1 uur bij 37 °C Geblokkeerd met PBS-Tween20 in 1% melk (PBS-Tw-M). De platen werden gewassen met PBS-Tween20 tussen incubatiestappen. Test de monsters werden na elkaar verwaterde tweeledig in PBS-Tw-M en geïncubeerd in de putten gedurende 1 uur bij 37 °C. Een tweede muis monoklonaal antilichaam mierikswortel peroxidase (HRP)-conjugaat gericht op ZIKV NS1 eiwit (kloon B-M6 R&D Biotech, Frankrijk) toegevoegd en werd geïncubeerd gedurende 90 min bij 37 °C. Vervolgens worden de platen werden geïncubeerd in het donker voor 45 min bij kamertemperatuur (RT) met een klaar-om-te-gebruik TetraMethylBenzidine (Tebu Bio, Laboratoria, Frankrijk) substraat. De reacties werden gestopt met 1 N HCl (VWR Prolabo). De optische dichtheid (od) werd gemeten bij 450-650 nm met een automatische plaatlezer. Een recombinant zikv NS1-eiwit (inheems antigeen, VK) werd gebruikt om een standaardkromme vast te stellen om het NS1-gehalte van de testmonsters te bepalen. De eiwitconcentratie werd bepaald als het gemiddelde van alle individuele concentraties voor de od-waarde van 0,2 tot 3,0. De detectielimiet (LOD) van de assay was 5 ng/mL.

immunologische assays

enveloppe-en NS1 – specifieke IgG ‘s

enveloppe-en NS1-specifieke IgG’ s werden beoordeeld met ELISA in 96-wells platen gecoat met recombinant e-eiwit (Meridian Life Science Inc., Memphis, USA) of recombinant non-structural protein 1 (NS1) protein (Native Antigen Company, Oxford, UK) in carbonate buffer, pH 9,6. Na blocking met PBS-Tween20-melk gedurende 60 min bij 37 °C werden tweevoudige verdunde serummonsters toegevoegd en gedurende 90 min bij 37 °C geïncubeerd. tussen incubatiestappen met PBS-Tween werden Wasstappen uitgevoerd. Een geit anti-monkey IgG HRP-conjugaat (ref AAI42P, BIO-RAD, Frankrijk), verdund in PBS-Tw-M bij 1:5000, werd toegevoegd en nog eens 90 minuten bij 37 °C geïncubeerd alvorens kleurontwikkeling met tetramethylbenzidine substraat (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, Frankrijk). De optische dichtheid werd gemeten bij 450-650 nm met een automatische plaatlezer. Titers voor e-specifieke IgG ‘ s werden berekend met behulp van een anti-ZIKV-apenreferentieserumregressiecurve. Titers voor NS1-specifieke IgG ‘ s werden berekend als de reciproke verdunning van het serum die met behulp van de tendencyfunctie een optische dichtheid van 1 oplevert. De titer van de referentie werd eerder berekend als het gemiddelde van verscheidene bepalingen van de wederzijdse verdunning die een optische dichtheid van 1,0 opleverden. Alle titers werden uitgedrukt in log10 ELISA-eenheden (EU). De LOD werd vastgesteld op 1,3 log10 EU en een willekeurige titer van 1,0 log10 werd toegewezen aan elke titer onder de LOD.

zikv-neutraliserende antilichamen

een zikv MN50-test met hoge doorvoer werd gebruikt voor het meten van ZIKV-specifieke neutraliserende antistoffen 22. Kort, warmte-geïnactiveerde sera werden serieel verdund, gemengd met ZIKV-PR en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 75 minuten. De mengsels werden vervolgens overgebracht naar 96-wells platen met samenvloeiende verocell monolagen. Na incubatie gedurende 5 dagen werden geïnfecteerde cellen gekleurd met gebiotinyleerd pan-flavivirus 4G2 mAb (HB112, Biotem, Frankrijk) en gevisualiseerd met 5-bromo-4-chloor-3-indolylfosfaat/nitro blauw tetrazolium in Levamisol substraat. Positieve putten werden gedefinieerd als ten minste één gekleurde infectieuze focus gedetecteerd. Voor elke verdunning werd het totale aantal negatieve putjes geregistreerd en werd de wederzijdse verdunning die overeenkomt met 50% van de virale neutralisatie berekend met behulp van de least square-methode en uitgedrukt als de neutralisatie log10 MN50-titer.

Memory B-cell enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay

Cryo-geconserveerde PBMC ‘ s werden snel ontdooid in een waterbad van 37 °C. Een mengsel van foetaal kalfsserum (FCS) / DNAse (100 µg/mL) werd langzaam toegevoegd aan de PBMC ‘ s, alvorens te worden overgebracht naar RPMIc (rpmi/10% FCS/glutamine/antibiotische cocktail). Na 1 uur bij 37 °C werden PBMC ‘ s geteld met behulp van de ViaCount Guava kit volgens de instructies van de fabrikant. De PBMCs werden geresuspendeerd in 1 × 106 cellen/mL in polyklonale stimulatie medium met RPMIc met R848 (resiquimod) op 1 µg/mL IL-2 op 10 ng/mL (zowel van Mabtech) en geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO2 voor 4 dagen om de differentiatie van B-geheugencellen in antilichaam-afscheidende cellen (ASC)37.

steriele 96-wells Multiscreen-IP-platen met PVDF-membranen (Millipore) werden vooraf geïncubeerd met 35 µL ethanol van 35% en vervolgens driemaal gewassen met steriele PBS 1X alvorens te worden gecoat met 100 µL anti-IgG humaan antilichaam (mabtech clone 3850-3-1000) om totale IgG-secretiecellen of pre-membraan en envelop (prM/env) virusachtige deeltjes (VLP) ZIKV of NS1 ZIKV (the Native Antigen Company, UK) te detecteren. De platen werden ‘ s nachts bij 4 °C geïncubeerd en vervolgens drie keer gewassen met steriel 1X PBS en verzadigd met RPMIc medium gedurende 2 uur bij 37 °C. RPMIc-medium werd vervolgens verwijderd en PBMC ‘ s werden toegevoegd bij 2500 en 5000 cellen in de met antilichamen gecoate opvangputten, en bij 200.000 en 400.000 cellen in de ZIKV prM/env VLP of ZIKV NS1-gecoate putjes, in RPMIc-medium. Elke toestand werd getest in drievoud en platen werden gedurende 20 uur bij 37 °C geïncubeerd met 5% CO2.

de platen werden tweemaal gewassen in PBS/Tween 20 (0,05%) en driemaal met PBS en geïncubeerd met een gebiotinyleerd anti-humaan IgG Ab (mabtech kloon MT78/145-biotine, Zweden) bij 1 µg/mL in PBS 1 × /0,5% BSA bij RT gedurende 1,5 uur. De platen werden verder vijf keer gewassen in PBS, en phycoerythrin-gelabeld streptavidin (Sigma, Frankrijk) verdund 1:100 met 0,5% PBS/BSA werd toegevoegd. De platen werden 1 uur lang geïncubeerd bij RT, daarna zes keer gewassen met PBS, gedroogd en in het donker bewaard. De platen werden gelezen met de hlw20 reader (Microvision Instrument) met behulp van IRIS software en geanalyseerd met Kosmische software. De resultaten worden uitgedrukt als het percentage antigeenspecifieke ASC ’s Onder de totale IgG ASC’ s.

T-cel ELISpot assays

ZIKV-specifieke T-cel immuunresponsen werden beoordeeld met behulp van ifny en IL-5 ELISpot assays met pools van 15-aminozuur (aa) peptiden met 11 AA overlappingen die betrekking hebben op de env, prM en capside zikv eiwitten (JPT, Duitsland). In het kort werden 96-wells Multiscreen-IP-platen met PVDF-membranen (Millipore) voorbehandeld met 35% ethanol, vervolgens ‘ s nachts bij 4 °C gecoat met 100 µL/putje anti-aap/humaan IFNy (Mabtech-kloon MT126L) of anti-humaan IL-5 (Mabtech-kloon TRFK5) bij 10 µg/mL in steriele PBS 1×. Na blokkering met RPMIc (rpmi/10% FCS/Glutamine/antibiotische cocktail) werden 3 × 105 ontdooide PBMC ‘ s in drievoud geïncubeerd met 2 µg/mL van elke zikv-peptiden of een irrelevante peptidepool (negatieve controle) in aanwezigheid van anti-CD28 (mAb CD28.2) en anti-CD49d (mAb 9F10) van Biolegend als co-stimulatoren. Pha (Remel)/PMA (SIGMA) stimulatie werd gebruikt als positieve controle. Na een 18-h incubatie bij 37 °C werden de platen gewassen in PBS-BSA 0.5% en geïncubeerd met gebiotinyleerd anti-humaan IFNy (Mabtech-kloon 7-B6-1) of gebiotinyleerd anti-humaan IL-5 (Mabtech-kloon 5A10) in 1 µg/mL, onder 100 µL/putje, gedurende 2 uur bij RT, in het donker. Na het wassen werden de platen vervolgens gedurende 1 uur bij RT geïncubeerd met streptavidine-PE (Zuidelijke Biotech), in het donker gevolgd door zes wasbeurten in PBS-BSA 0,5%.

de platen werden gelezen met de hlw20 reader (Microvision Instrument) met behulp van IRIS software en geanalyseerd met Kosmische software. De resultaten werden uitgedrukt als het aantal ifny-of IL-5-spotvormende cellen (SFC) per 106 PBMC ‘ s.

statistische methoden

alle gegevens werden log-getransformeerd vóór statistische analyses. Van D0 tot D164 werden de analyses van de humorale responsen uitgevoerd met behulp van een longitudinaal model van analyse van varianties met herhaalde metingen op verschillende tijdstippen voor elke aap. Het tijdseffect werd gemodelleerd met behulp van een kwadratisch effect. Om de challenge-en boost-effecten te modelleren, werd voor elke read-out een longitudinaal model van variantieanalyse gebruikt. Voor elke aap werd in het model rekening gehouden met herhaalde metingen op verschillende tijdstippen. Tukey of Dunnett aanpassingen werden uitgevoerd voor meerdere vergelijkingen.

voor de celgemedieerde immuniteit werden vergelijkingen tussen groepen of tijdpunten gemaakt door een eenrichtingsanova of door gebruik te maken van een longitudinaal model, afhankelijk van de biologische vraag.

alle analyses werden uitgevoerd met SAS ® V9.4 software op een alfaniveau van 0,05. P-waarden lager dan deze waarde gaven statistisch significante verschillen aan.

ethische overwegingen

alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited animal facilities, in overeenstemming met de Europese Richtlijn 2010/63 en de Franse nationale regelgeving. De protocollen werden goedgekeurd door het ethische Comité voor dierproeven van Sanofi Pasteur.

de makaken die in het challenge-onderzoek werden gebruikt, werden aan het einde van het onderzoek (4 maanden na de challenge) om redenen van bioveiligheid op humane wijze geëuthanaseerd, aangezien ZIKV incidenteel persistent is bij makaken.30 Dieren gebruikt voor de booster studie werden hergebruikt in andere onderzoeksexperimenten.

Rapporteringssamenvatting

nadere informatie over de opzet van het onderzoek is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde samenvatting van de Nature Research Reporting.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.