optimoitu puhdistettu inaktivoitu Zika-rokote antaa pitkäkestoisen immunogeenisuuden ja suojan cynomolgus makakeille

ZPIV-ja ZPIV-SP-rokotevalmisteille

ZPIV-ehdokas (vaiheen I kliininen erä) oli WRAIR16. Rokote toimitettiin nestemäisessä muodossa, valmiina injektiota varten, 5 µg proteiinia annosta kohti (500 µL), mikä vastaa 200 antigeenistä yksikköä (AU) ja joka on valmistettu AlOOH: lla. Optimoitu rokote (ZPIV-sp) valmistettiin Sanofi Pasteurissa (Marcy l ’ Etoile, Ranska) käyttäen WRAIR-prosessia lähtökohtana seuraavin parannuksin. Zikv-PR: n alkuvahvistuksen jälkeen Sanofi Pasteur Vero-soluissa virus-RNA erotettiin ja siirrettiin Sanofi Pasteurin seerumittomiin (spsf) Vero-soluihin. Talteen otettu virus monistettiin, plakki puhdistettiin kahdesti ja edelleen monistettiin niin, että saatiin valmiiksi Master-siemenerä, josta saatiin isäntä ja toimiva siemenerä. Virusta valmistettiin 180 litran bioreaktorissa SPSF Vero-soluilla. Tämän jälkeen virus kirkastettiin, puhdistettiin ultracentrifugoimalla modifioidulla raja-ja kromatografialla ja inaktivoitiin formaliinikäsittelyllä. Puhdistus-ja inaktivointivaiheiden parametrit optimoitiin WRAIRIN käyttämiin olosuhteisiin verrattuna. Lääkevalmisteen zikv-kirjekuoren (E) antigeenipitoisuus säädettiin ELISA-menetelmällä 400 AU/mL: ksi (vastaten 10 µg/mL ZPIV-proteiineja) ja kylmäkuivattiin. Kylmäkuivatun rokotteen pitoisuudeksi säädettiin 100, 200 tai 400 AU/annos (500 µL) ja se suspendoitiin uudelleen AlOOH—geeliin (500 µg / annos-Brenntag Biosector, Tanska). AU määriteltiin ELISA-menetelmällä mitattuna kirjekuoren antigeenipitoisuutena (env).

rokotusohjelma

neljä kuuden flavivirusnegatiivisen urospuolisen cynomolgus-makakien (Macaca fascicularis – Noveprim) ryhmää, 2-vuotiaat, saivat 500 µL ensimmäisen sukupolven ZPIV-valmistetta (ryhmä A: 200 AU) tai optimoitua ZPIV-SP-valmistetta (ryhmä B: 100 AU, ryhmä C: 200 AU tai ryhmä D: 400 AU) lihakseen (IM) oikeassa kvadricepsissä päivänä 0 (D0) ja vasen nelikulmio D28: lla. Kuusi kuukautta myöhemmin (D176) B-ryhmän kuusi makakia, jotka olivat saaneet 100 AU ZPIV-SP: tä, saivat saman lääkemuodon tehosteannoksen ja joita seurattiin 6 kuukauden ajan (Kuva. 1). Muita ryhmiä käytettiin virushaasteeseen.

kliininen seuranta

välittömiä reaktioita havaittiin 30 minuutin kuluessa ja mahdollisia paikallisia reaktioita injektiokohdassa 7 päivän aikana jokaisen rokotuksen jälkeen. Makakeja seurattiin päivittäin, ja koko tutkimuksen ajan kirjattiin oireita, kuten vähentynyt ruokailu, rajoitettu liikkuvuus, polypnea, paikalliset ja systeemiset reaktiot. Potilaan paino ja ruumiinlämpö (transponderisiruja käyttäen) kirjattiin lähtötilanteessa ja säännöllisin väliajoin koko tutkimuksen ajan.

verinäytteenotto immunogeenisuusarvioinnin jälkeen

seerumeita kerättiin eri ajankohtina 6 kuukauden aikana annosten 1 ja 2 jälkeen (D0-D164) ja Boostin jälkeen ryhmässä B (D15-D170) humoraalisten vasteiden arvioimiseksi, mukaan lukien ZIKV: tä neutraloivat vasta-aineet mn50-määrityksellä ja ZIKV Env ja NS1-spesifinen IgG ELISA-menetelmällä.

pbmc: t kerättiin lähtötilanteessa, D7, D35, D90 ja D164, soluvälitteisen immuniteetin ja muistin B-soluvasteiden arvioimiseksi.

haaste villin tyypin ZIKV-PR: llä

viisi kuukautta 2-annoksen jälkeen (d176) ryhmien A, C, D ja kuuden aiemmin hoitamattoman makakin (ryhmä E: valekontrolli) makakeille altistettiin 105 plakkia muodostavalla yksiköllä (PFU laimennettuna fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS)) wt-ZIKV-PR: stä (kanta PRVABC59 CDC: stä) ihonalaisella injektiolla (SC) oikean käsivarren hartialihaksen alueelle.ja nukutuksessa (zoletil®) (kuva. 1). Altistusannos ja antoreitti valittiin edellisen tutkimuksen tulosten perusteella (julkaisemattomat tulokset).

biologiset näytteet altistuksen jälkeen

plasmaa kerättiin joka päivä 7 päivän ajan ja altistuksen jälkeen D9 ja D15 virologisissa määrityksissä. CSF (100-300 µL) kerättiin Cisterna Magnasta D7, D15 ja D28 post-challenge. Veren kontaminaation puuttuminen aivo-selkäydinnesteestä varmistettiin silmämääräisellä tarkastuksella ja näytteet säilytettiin -80 °C: ssa.sylkeä kerättiin joka päivä 15 päivän ajan ja silmänesteitä otettiin näytteellä D7 ja D15 altistuksen jälkeen. Pyyhkäisynäytteet laitettiin myöhemmin putkiin, joissa oli 500 µL RNA: ta (Invitrogen, USA), ja ne sekoitettiin pyörteillä. Näytteet hävitettiin ja eluaatteja säilytettiin -80 °C: ssa analysointiin asti.

immunologisissa määrityksissä plasmaa kerättiin useina ajankohtina D15: stä D112: een ja Pbmc: Itä kerättiin D35: stä ja D112: sta.

viremia ja viruskuormitus biologisissa nesteissä altistuksen jälkeen

ZIKV-RNA plasmassa, syljessä, silmänesteessä ja aivo-selkäydinnesteessä ryhmien A, C, D ja E näytteissä määritettiin altistuksen jälkeen qRT-PCR-menetelmällä, jossa kohdistettiin NS5-gene22. Kokonaisgenominen RNA uutettiin näytteistä ensin Macherey Nagel NucleoSpin® 96-viruspaketilla (Macherey Nagel, Saksa) Tecan Evowaren automatisoidulla RNA-uuttotyöasemalla valmistajan ohjeiden mukaisesti ja eluoitiin nukleaasittomassa vedessä.

Sandwich ELISA zikv NS1-antigeenin

Zikv NS1-antigeenijäämän kvantifioimiseksi määritettiin Sandwich ELISA-menetelmällä altistukseen käytetystä virusvalmisteesta. Se mitattiin myös laimentamattomana ja laimennettuna (1:30) plasmanäytteet, jotka on kerätty lähtötilanteessa, D1, D2, D3, D4 ja D5 kaikista altistuneista ryhmistä epäsuorana menetelmänä viruksen replikaation arvioimiseksi.

lyhyesti 96-kuoppaiset ELISA-levyt päällystettiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen zikv NS1-proteiinille (klooni B-J5 r&D Biotech, Ranska) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa 1 × (PBS). Tämän jälkeen sitomattomat alueet suljettiin 1 tunniksi 37 °C: n lämpötilassa PBS-Tween20: llä 1-prosenttisessa maidossa (PBS-TW-M). Levyt pestiin haudontavaiheiden välissä PBS-Tween20: llä. Testinäytteet laimennettiin sarjallisesti kaksinkertaisiksi PBS-Tw-M: llä ja inkuboitiin kuoppiin 1 tunnin ajan 37 °C: ssa.lisättiin toinen hiiren monoklonaalinen vasta-aine piparjuuriperoksidaasi (HRP)-konjugaatti, joka ohjattiin ZIKV NS1-proteiiniin (klooni B-M6 r&D Biotech, Ranska) ja inkuboitiin 90 minuutin ajan 37 °C: ssa. tämän jälkeen levyjä inkuboitiin pimeässä 45 minuutin ajan huoneenlämmössä (rt), jossa on käyttövalmis tetrametyylibentsidiinisubstraatti (Tebu-Bio Laboratories, Ranska). Reaktiot lopetettiin annoksella 1 N HCl (VWR Prolabo). Optinen tiheys (OD) mitattiin 450-650 nm: ssä automaattisella levylukijalla. ZIKV NS1-rekombinanttiproteiinia (Native Antigen, UK) käytettiin standardikäyrän muodostamiseen testinäytteiden NS1-pitoisuuden määrittämiseksi. Proteiinipitoisuus määritettiin kaikkien yksittäisten pitoisuuksien keskiarvona OD-arvoalueella 0,2-3,0. Määritysraja (Lod) oli 5 ng/mL.

immunologiset määritykset

kirjekuori – ja NS1-spesifiset IgG: t

kirjekuori – ja NS1-spesifiset IgG: t arvioitiin ELISA: lla 96-kuoppaisilla levyillä, jotka oli päällystetty rekombinantti E-proteiinilla (Meridian Life Science Inc., Memphis, USA) tai rekombinantti ei-rakenteellinen proteiini 1 (NS1) proteiini (Native Antigen Company, Oxford, UK) karbonaattipuskurissa, pH 9, 6. PBS-Tween20-milk-valmisteen eston jälkeen 60 minuutin ajan 37 °C: ssa lisättiin kaksinkertaiset laimennetut seeruminäytteet, joita inkuboitiin 90 minuutin ajan 37 °C: ssa.inkubaatiovaiheiden välillä suoritettiin pesuvaiheet PBS-Tween-valmisteella. PBS-Tw-M:llä 1: 5000 laimennettua goat anti-monkey IgG HRP-konjugaattia (Ref AAI42P, BIO-RAD, Ranska) lisättiin ja inkuboitiin vielä 90 minuuttia 37 °C: ssa ennen värikehitystä tetrametyylibentsidiinisubstraatilla (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, Ranska). Optinen tiheys mitattiin 450-650 nm: ssä automaattisella levylukijalla. E-spesifisten IgG: iden tiitterit laskettiin käyttäen anti-ZIKV-apinoiden seerumin regressiokäyrää. NS1-spesifisten IgG: iden titterit laskettiin seerumin käänteislaimennuksena, jolloin optinen tiheys oli 1 tendenssitoimintoa käyttäen. Referenssin titteri laskettiin aiemmin useiden sellaisten määritysten keskiarvona, joissa vastavuoroinen laimennus antoi optisen tiheyden 1,0. Kaikki tiitterit ilmaistiin log10 ELISA-yksikköinä (EU). LOD-arvoksi asetettiin 1.3 log10 EU ja kullekin LOD-arvon alapuolella olevalle titterille annettiin mielivaltainen titteri 1.0 log10.

zikv: n neutraloivat vasta-aineet

zikv: n spesifisten neutraloivien antibodies22: n mittaamiseen käytettiin suuritehoista ZIKV MN50-määritystä. Lyhyesti, heat-inaktivoidut Seerumit laimennettiin sarjamaisesti, sekoitettiin ZIKV-PR: ään ja inkuboitiin 37 °C: ssa 75 minuutin ajan. Tämän jälkeen seokset siirrettiin 96-kuoppaisiin levyihin, jotka sisälsivät confluentteja Vero-solumonolikerroksia. 5 päivän inkubaation jälkeen infektoituneet solut värjättiin biotinyloidulla pan-flaviviruksella 4G2 mAb (Hb112, Biotem, Ranska) ja visualisoitiin 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatilla/nitrosinisellä tetratsoliumilla Levamisolisubstraatissa. Positiiviset kuopat määriteltiin vähintään yhdeksi havaituksi värilliseksi tartunnankohteeksi. Jokaisesta laimennuksesta kirjattiin negatiivisten kuoppien kokonaismäärä ja 50%: A viruksen neutralisaatiosta vastaava vastavuoroinen laimennus laskettiin käyttäen pienimmän neliösumman menetelmää ja ilmaistiin neutralisaatiolog10 MN50-titterinä.

muisti-B-solujen entsyymeihin liittyvä immunospot (ELISpot)-määritys

Kryosäilötyt Pbmc: t sulatettiin nopeasti 37 °C: n asteisessa vesihauteessa. PBMCs: ään lisättiin hitaasti sikiön vasikkaseerumin (FCS) / Dnaasin (100 µg/mL) seos, ennen kuin se siirrettiin rpmic: iin (RPMI/10% FCS/glutamiini/antibiootticocktail). 1 tunnin kuluttua 37 °C: n lämpötilassa Pbmc-yhdisteet laskettiin ViaCount Guava-pakkauksella valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pbmc-solut suspendoitiin uudelleen 1 × 106 soluun/mL polyklonaalisessa stimulaatioalustassa, joka sisälsi rpmic: tä r848: lla (resikimodi) 1 µg/mL: lla ja IL-2: ta 10 ng/mL: lla (molemmat mabtech-valmisteesta) ja inkuboitiin 37 °C: ssa 5% CO2: lla 4 päivän ajan, jotta muisti-B-solut eriytyivät vasta-aineita erittäviksi soluiksi (ASC)37.

steriilit 96-kuoppaiset Multiscreen-IP-levyt, joissa on PVDF-kalvoja (Millipore), esikarsittiin 35 µL: lla 35-prosenttista etanolia ja pestiin sen jälkeen kolme kertaa steriilillä PBS 1X: llä, ennen kuin ne päällystettiin 100 µL: lla anti-IgG-ihmisen vasta-ainetta (Mabtech-klooni 3850-3-1000) IgG: tä erittävien solujen tai PRM / env-viruksen kaltaisten hiukkasten (VLP) zikv: n tai NS1 ZIKV: n havaitsemiseksi. (the native antigen company, Yhdistynyt kuningaskunta). Levyt inkuboitiin yön yli 4 °C: ssa, minkä jälkeen ne pestiin kolme kertaa steriilillä 1x PBS: llä ja kyllästettiin RPMIc-väliaineella 2 tunnin ajan 37 °C: ssa. Tämän jälkeen poistettiin RPMIc-aine ja lisättiin Pbmc: tä 2500 ja 5000 solussa vasta-ainepäällysteisissä talteenottokaivoissa ja 200 000 ja 400 000 solua Zikv prM/env VLP-tai ZIKV NS1-pinnoitetuissa kaivoissa RPMIc-liuoksessa. Jokainen tila testattiin kolmena kappaleena ja levyjä inkuboitiin 20 tunnin ajan 37 °C: n lämpötilassa 5% CO2: n kanssa.

levyt pestiin kahdesti PBS/Tween 20: llä (0, 05%) ja kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin biotinyloidulla anti-human IgG Ab: llä (Mabtech-klooni MT78/145-biotiini, Ruotsi) 1 µg /mL: lla PBS 1 × / 0, 5% BSA: ssa RT: ssä 1, 5 tunnin ajan. Levyt pestiin vielä viisi kertaa PBS:llä, ja phycoerytriinillä merkittyä streptavidiinia (Sigma, Ranska) lisättiin 0, 5% PBS/BSA: lla laimennettuna 1: 100. Levyt inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: llä, minkä jälkeen ne pestiin kuusi kertaa PBS: llä, kuivattiin ja pidettiin pimeässä. Levyt luettiin HLW20-lukulaitteella (Microvision Instrument) IRIS-ohjelmiston avulla ja analysoitiin kosmisella ohjelmistolla. Tulokset ilmaistaan antigeenispesifisten ASCs-pitoisuuksien prosenttiosuutena IgG-pitoisuuksien kokonaismäärästä.

T-solujen ELISpot-määritykset

ZIKV-spesifiset T-solujen immuunivasteet arvioitiin IFNy: n ja IL-5 ELISpot-määrityksissä käyttäen 15-aminohappopeptidin (aa) pooleja, joissa oli 11 AA-päällekkäisyyttä Env -, prM-ja Kapsid-zikv-proteiinien kanssa (jpt, Saksa). Lyhyesti 96-kuoppaisia Multiscreen-IP-levyjä, joissa on PVDF-kalvoja (Millipore), esikäsiteltiin 35-prosenttisella etanolilla, minkä jälkeen ne päällystettiin yön yli 4 °C: ssa Anti-monkey/human IFNy (Mabtech-klooni MT126L)-tai anti-human IL-5 (Mabtech-klooni TRFK5) – liuoksella 10 µg/mL steriilissä PBS 1×. Kun biolegendin anti-CD28 (MAB CD28.2) ja anti-CD49d (MAB 9F10) estettiin rpmic: llä (RPMI/10% FCS/glutamiini/antibiootticocktail), 3 × 105 sulatettua Pbmc: tä inkuboitiin kolmena kappaleena 2 µg/mL: lla kutakin ZIKV-peptidiä tai epäolennaista peptidipoolia (negatiivinen kontrolli) samanaikaisesti biolegendin anti-CD28: n (Mab CD28.2) ja anti-CD49d: n (MAB 9F10) kanssa. Positiivisena kontrollina käytettiin Pha (Remel)/PMA (SIGMA) – stimulaatiota. 18 tunnin inkubaation jälkeen 37 °C: ssa levyt pestiin PBS-BSA 0: ssa.5% ja inkuboidaan biotinyloidulla Anti-human IFNy: llä (Mabtech-klooni 7-B6-1) tai biotinyloidulla anti-human IL-5: llä (Mabtech-klooni 5A10) 1 µg/mL, alle 100 µL/kuoppa, 2 tunnin ajan sädehoidossa pimeässä. Pesun jälkeen lautasia inkuboitiin streptavidiini-PE: lla (Southern Biotech) 1 tunnin ajan RT: ssä, minkä jälkeen pimeässä kuusi pesua PBS-BSA: ssa 0,5%.

levyt luettiin HLW20-lukulaitteella (Microvision Instrument) IRIS-ohjelmiston avulla ja analysoitiin kosmisen ohjelmiston avulla. Tulokset ilmaistiin ifny-tai IL-5-pilkunmuodostussolujen (SFC) lukumääränä 106 Pbmc: tä kohti.

tilastolliset menetelmät

kaikki tiedot log-muunnettiin ennen tilastollisia analyysejä. Humoraalivasteiden analyysit tehtiin D0-D164 käyttäen varianssien pitkittäistä analyysimallia, jossa kullekin apinalle tehtiin toistetut mittaukset eri ajankohtina. Aikaefekti mallinnettiin kvadraattisella efektillä. Challenge-ja boost-vaikutusten mallintamiseksi käytettiin varianssin pituussuuntaista analyysimallia jokaista lukua varten. Jokaisen apinan kohdalla mallissa otettiin huomioon toistuvat mittaukset eri ajankohtina. Tukey tai Dunnett oikaisut tehtiin useita vertailuja.

soluvälitteisen immuniteetin osalta ryhmien tai aikapisteiden väliset vertailut tehtiin yksisuuntaisella ANOVALLA tai käyttämällä pitkittäistä mallia biologisesta kysymyksestä riippuen.

kaikki analyysit tehtiin SAS® v9.4-ohjelmistolla alfa-tasolla 0,05. Tätä arvoa pienemmät p-arvot osoittivat tilastollisesti merkitseviä eroja.

eettiset näkökohdat

kaikki eläinkokeet tehtiin koe-eläinten hoitoon akkreditoitujen koe-eläinten tilojen arviointia ja akkreditointia käsittelevän yhdistyksen (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited animal facilities) mukaisesti Euroopan direktiivin 2010/63 ja Ranskan kansallisten säännösten mukaisesti. Sanofi Pasteurin eläinkokeiden eettinen komitea hyväksyi protokollat.

altistustutkimuksessa käytetyt makakit lopetettiin humaanisti tutkimuksen lopussa (4 kuukautta altistuksen jälkeen) bioturvallisuussyistä, sillä ZIKV: n on raportoitu ajoittain pysyvän makakeilla 30. Tehostetutkimuksessa käytettyjä eläimiä käytettiin uudelleen muissa tutkimuskokeissa.

raportointikooste

lisätietoja tutkimuksen suunnittelusta on tämän artikkelin yhteydessä olevassa Nature Research Reporting Summary-julkaisussa.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.