wirus Keystone wyizolowany od nastolatka z Florydy z wysypką i gorączką subiektywną: kolejny endemiczny Arbovirus w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych?

Abstract

Keystone virus, California-serogrupa orthobunyavirus, został po raz pierwszy wyizolowany w 1964 od komarów w Keystone na Florydzie. Nie było wcześniejszych doniesień o izolacji od ludzi, pomimo badań sugerujących, że ~20% osób żyjących w regionie jest seropozytywnych. Zgłosiliśmy izolację wirusa od nastolatka z Florydy z wysypką i gorączką.

pojawienie się wirusa Zika (ZIKV) i ciągła identyfikacja wirusa Chikungunya i zakażeń wirusem dengi wywołały rosnące obawy dotyczące endemiczności i rozprzestrzeniania się arbowirusów w Stanach Zjednoczonych. Wirus Keystone (KEYV; Rodzaj Orthobunyavirus, Rodzina Peribunyaviridae), członek kalifornijskiej grupy serologicznej Orthobunyavirus, został po raz pierwszy wyizolowany z komarów w Keystone na Florydzie (w pobliżu zatoki Tampa) w 1964 roku . Późniejsze badania wykazały powszechne rozprzestrzenianie się wirusa w komarach, szczególnie Aedes atlanticus, a także w wiewiórkach, szopach i Jeleniach białogłowych, w regionach przybrzeżnych rozciągających się od zatoki Chesapeake na południe przez Florydę i tak daleko na zachód, jak Teksas .

w badaniach przeprowadzonych na populacjach ludzkich w latach 60 .XX wieku wskaźniki seropozytywności mieściły się w przedziale 19-21%. Jednak nigdy wcześniej nie zgłoszono faktycznej izolacji KEYV od ludzi, ani nie powiązano KEYV z zespołem klinicznym u ludzi, pomimo pozornej endemiczności u zwierząt i komarów.

opis przypadku

16-letni wcześniej zdrowy mężczyzna przedstawiony w sierpniu 2016 r.do poradni ratunkowej w północno-środkowej Florydzie z historią niskiej gorączki i rozproszonej wysypki skórnej. Pacjent zgłaszał uczucie „ciepła” poprzedniego wieczoru, z temperaturą szacowaną przez rodziców na ~ 100 ° F. Rumieniowa wysypka grudkowa pojawiła się rano, zaczynając od klatki piersiowej i stopniowo rozszerzając się na brzuch, ramię, plecy i twarz. Nie było pęcherzyków, a wysypka była bezbolesna i nie świąd. Było to pogarszane przez ciepło i światło słoneczne. Pacjent zaprzeczył dreszcze, ból głowy, sztywność szyi, lub objawy żołądkowo-jelitowe. Zauważył łagodne zmęczenie i dyskomfort w kostce, który przypisywał jednoczesnej obecności na letnim obozie dla uczestników orkiestr marszowych, noszących nowe buty. W poprzednim tygodniu u pacjenta zdiagnozowano możliwe zapalenie migdałków i poddano leczeniu amoksycyliną w dawce 500 mg przyjmowaną doustnie 3 razy na dobę, którą sam przerwał następnego dnia. Nie miał żadnej ważnej przeszłości medycznej lub chirurgicznej, żadnych znanych chorób immunosupresyjnych lub wrodzonych, żadnych znanych alergii, żadnych niedawnych podróży poza środkową Florydę, ani narażenia na gospodarstwa lub zwierzęta gospodarskie. Otrzymał wszystkie zalecane szczepienia dziecięce. Żaden inny członek rodziny nie był chory. Pacjent i jego rodzina przenieśli się na Florydę z Kansas (gdzie wirus Keystone nie został zidentyfikowany) 4 lata przed zgłoszoną chorobą. Obóz, w którym uczęszczał, trwał do wieczora i donosił, że był wielokrotnie ugryziony przez komary, pomimo zastosowania dietylotoluamidu (powszechnie znanego jako DEET).

podczas badania w klinice miał temperaturę 98,5°F (36,9°C), puls 69 uderzeń/minutę, częstość oddechów 12 oddechów/minutę i ciśnienie krwi 122/82 mm/Hg. Zaobserwowano rozproszoną, rumieniowatą, grudkową wysypkę tułowia, ramienia i twarzy(ryc. 1). Badania głowy, szyi, układu oddechowego, sercowo-naczyniowego i brzusznego pacjenta były prawidłowe. Szybki test Monospot przeprowadzony w klinice był negatywny. Za zgodą pacjenta i jego rodziców pobrano próbki śliny i moczu. Wysypka ustąpiła po 2 dniach i nie wystąpiła gorączka. Następnie przyjął amoksycylinę bez pojawienia się wysypki.

Rysunek 1.

wysypka obserwowana u 16-letniego pacjenta.

Rysunek 1.

wysypka obserwowana u 16-letniego pacjenta.

identyfikacja/izolacja wirusa

Przesiewacze łańcuchowej reakcji polimerazy odwrotnej transkrypcji

ponieważ u pacjenta wystąpiła wysypka i gorączka w wywiadzie w okresie, gdy na Florydzie wystąpiła epidemia ZIKV, próbki śliny i moczu były ujemne na obecność genomowego kwasu rybonukleinowego (RNA) serotypu 1-4 wirusa Chikungunya metodą odwrotnej transkrypcyjnej reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) . Możliwość etiologii alfawirusa lub flawiwirusa została następnie oceniona poprzez wykonanie RT-PCR przy użyciu uniwersalnych starterów wykrywających alfawirusy i flawiwirusy w Brazylii . Zarówno na ślinie, jak i w próbkach moczu stwierdzono ujemny wynik na obecność alfawirusów i flawiwirusów vrna, podczas gdy kontrole pozytywne przebiegały zgodnie z oczekiwaniami (dane nie zostały przedstawione).

bezstronna Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją i sekwencjonowanie w celu identyfikacji domniemanego czynnika etiologicznego wirusa

po modyfikacji procedury, którą wcześniej opisaliśmy, uzyskano domniemaną tożsamość wirusa ; szczegółowe metody przedstawiono w dodatkowych danych dołączonych do niniejszego artykułu. Genomowy RNA wirusa (i / lub kwas deoksyrybonukleinowy ) ekstrahowano z wirionów przy użyciu Mini Kit QIAamp Viral RNA (Qiagen Inc.). Amplikonów PCR oczyszczono (Qiagen QIAquick PCR purification kit) i a-tailon z polimerazy DNA TAQ (New England Biolabs). Amplikonów PCR a-ogonowy następnie ta-klonowane, i inserty sekwencjonowane za pomocą sekwencjonowania Sanger. Spośród 40 plazmidów z klonowanymi wstawkami TA (20 wstawek z moczu, 20 ze śliny), 1 z moczu zawierał wstawkę o długości 166 bp z 99% tożsamością sekwencji małego genomu wirusa Keystone zdeponowanych w GenBank (KT630293.1, U12801.1 i KT630290.1).

bezpośrednie sekwencjonowanie wirusa Keystone w moczu

ponieważ istnieje wiele ortobunyawirusów, a opublikowane startery RT-PCR do sekwencjonowania KEYV nie były dostępne, wirus zsekwencjonowano przy użyciu specjalnie zaprojektowanych starterów w oparciu o 3 dostępne, kompletne genomy wirusa Keystone w GenBank. Sekwencjonowanie dokonywało się przy użyciu strategii chodzenia genomu, z starterami PCR opisanymi w dodatkowej Tabeli 1; nasze kompletne metody są zawarte w danych uzupełniających. Sekwencja została oznaczona jako KEYV / Homo sapiens / Gainesville-1/2016; 3 sekwencje segmentów genomu zostały zdeponowane w GenBank pod numerami akcesyjnymi MH016784 (segment duży), MH016785 (segment średni) i MH016786 (segment mały). Kompletna sekwencja genomu L ma 98 do 99% tożsamości z odpowiednimi genomami tylko 3 innych kompletnych sekwencji L wirusa Keystone dostępnych w Genbank (KT630288.1, KX817321.1 i KT630291. 1). Podobnie, kompletny Genom M ma 98 do 99% wspólnego z odpowiednimi sekwencjami m (AF123489.1, KT630289.1 i KX817322.1) i 99% wspólnego z odpowiednimi sekwencjami genomu s (KT630293.1, U12801.1 i KT630290.1).

izolacja i wizualizacja wirusa Keystone w hodowanych komórkach

ponieważ wirus keystone vRNA został wykryty przez bezstronne sekwencjonowanie (a później został w pełni zsekwencjonowany), podjęto próby wyizolowania wirusa w linii komórkowej znanej jako wspierającej jego wzrost (komórki Vero) i w linii komórkowej neuroblastoma myszy Neuro-2A; opis kompletnych metod znajduje się w danych uzupełniających. Mieszane efekty cytopatyczne wywołane wirusem (CPE) były widoczne w komórkach Neuro-2A po 2 dniach od zaszczepienia komórek moczem, ale nie śliną, i to samo zaobserwowano 1 dzień później w komórkach Vero E6. Po subkulturze, CPE były widoczne 2 dni po zaszczepieniu komórek Vero E6 ze zużytymi mediami z zaszczepionego moczu Neuro-2A. indukowany przez KEYV CPE utworzony w komórkach Vero E6 przedstawiono na dodatkowych rysunkach S1A i S1B; zarówno pierwotne komórki Vero E6 zaszczepione moczem, jak i Vero E6 zaszczepione zakażonymi wirusami komórkami Neuro-2A tworzyły ten sam typ CPE. Supernatanty z komórek zakażonych wirusem były dodatnie dla KEYV vRNA przez RT-PCR, podczas gdy te z próbnych zaszczepionych kontroli były ujemne dla KEYV vRNA.

aby wykazać aktywną replikację wirusa Keystone, komórki Vero E6 wykazujące znaczący CPE (>70% jednowarstwowej zakażonej komórki) 40 godzin po zakażeniu analizowano transmisyjną mikroskopią elektronową i wykazano, że wykazują typowe indukowane przez bunyawirusa CPE i produkcję wirionów potomnych. Metody i obrazy (rysunki uzupełniające S2A-F) są zawarte w danych uzupełniających.

komentarz

KEYV, ujemnie wyczuwalny jednoniciowy wirus RNA, jest zazwyczaj umieszczany w czymś, co zostało nazwane „kalifornijską Serogrupą” rodzaju Orthobunyavirus, która obejmuje między innymi Kalifornijski wirus zapalenia mózgu, wirus Jamestown Canyon i wirus La Crosse encephalitis. KEYV, na podstawie badań przeprowadzonych w latach 60. i 70., wydaje się być szeroko rozpowszechniony na obszarach przybrzeżnych południowo-wschodnich Stanów Zjednoczonych, z izolatami zidentyfikowanymi (w próbkach komarów i zwierząt) od zatoki Chesapeake do Teksasu. Wydaje się, że organizm posiada wiele żywicieli kręgowców, w tym, jak wcześniej zauważono, wiewiórkę szarą (30% seropozytywności w badaniu na bagnach cyprysów Pokomoke w Maryland), szopy (18% seropozytywności w tym samym badaniu) i jelenie białawe (10% seropozytywności w badaniu Maryland; 2% seropozytywności w badaniu w Teksasie ); wydaje się być rzadki w populacjach ptaków lub gadów. Wirus może być przenoszony przez komary, przy czym A. atlanticus wydaje się być głównym wektorem (chociaż KEYV został zidentyfikowany u innych gatunków Aedes i Culex ). Wyłania się obraz wirusa endemicznego dla komarów i leśnych kręgowców, choć o niepewnym znaczeniu klinicznym w populacjach zwierząt.

pojawia się zatem pytanie o znaczenie KEYV dla ludzi. Badania seroprewalencji przeprowadzone 50 lat temu przy użyciu testów neutralizacji wirusa sugerowały, że seropozytywność w zdrowych populacjach ludzkich wynosiła 20% . Nasze dane wykazały, że infekcje u ludzi mogą (i nadal występują) wystąpić, przy czym żywy wirus jest wykrywalny w moczu. Chociaż nie możemy zdecydowanie powiedzieć, że wirus był odpowiedzialny za wysypkę i zgłoszoną gorączkę, nasze dane są wyraźnie sugerujące, i podnieść możliwość, że część tego, co w przeciwnym razie są nijakie przypadki wysypki i gorączki obserwowane w placówkach podstawowej opieki zdrowotnej w obszarach przybrzeżnych południowo-wschodnich Stanów Zjednoczonych faktycznie odzwierciedlają infekcje KEYV. Wiele wirusów z grupy kalifornijskiej było związanych z zapaleniem mózgu i, jak wykazano w tym raporcie, wirus dobrze rośnie w liniach komórkowych neuroblastoma; w przypadkach wirusowego zapalenia mózgu, w których nie określono etiologii, warto również szukać infekcji KEYV. W obecnym przypadku, w kontekście obaw związanych z zakażeniem ZIKV, kompleksowa ocena wirusologiczna doprowadziła do izolacji wirusa; jest wysoce mało prawdopodobne, aby poza podobnymi badaniami kiedykolwiek został on zidentyfikowany. Nasze wyniki podkreślają różnorodność potencjalnych patogenów arboviralnych w tym regionie i sugerują, że kompleksowa analiza możliwych patogenów wirusowych powinna obejmować diagnostykę dla KEYV.

dane uzupełniające

Materiały uzupełniające są dostępne na stronie internetowej Clinical Infectious Diseases. Składające się z danych dostarczonych przez autorów na rzecz czytelnika, zamieszczone materiały nie są kopiowane i są wyłączną odpowiedzialnością autorów, dlatego pytania lub komentarze należy kierować do odpowiedniego autora.

uwagi

wsparcie finansowe. Prace te zostały wsparte wewnętrznymi funduszami z University of Florida Emerging pathogen Institute oraz Department of Environmental and Global Health, College of Public Health and Health Professions.

potencjalne konflikty interesów. Wszyscy autorzy: brak zgłoszonych konfliktów interesów. Wszyscy autorzy przesłali formularz ICMJE w celu ujawnienia potencjalnych konfliktów interesów. Ujawniono konflikty, które redakcja uważa za istotne dla treści manuskryptu.

Bond
JO

,

Hammon
WM

,

Lewis
AL

,

Sather
GE

,

Taylor
DJ

.

kalifornijskie arbowirusy na Florydzie i raport o nowym szczepie, wirusie Keystone

.

przedstawiciel zdrowia publicznego
1966

;

81

:

607

13

.

Leduk
JW

,

Burger
JF

,

Eldridge
BF

,

Russell
PC

.

Ekologia wirusa Keystone, transowarialnie wspieranego arbowirusa

.

Ann. I. Acad.
1975

;

266

:

144

51

.

sędzia
WD

,

Newhouse
WF

,

Kaliszer
CH

,

Chamberlain
RW .

Arbowirusy grupy kalifornijskiej: wydzieliny komarów w Ameryce Północnej

.

wiadomości o komarach
Rok 1971

;

31

:

576

600

.

Issel
CJ

,

Hoff
GL

,

trener
powrót

.

serologiczne dowody zakażenia Jelenia bielika w Teksasie trzema arbowirusami grupy kalifornijskiej (Jamestown Canyon, San Angelo i Keystone)

.

J Wildl Dis
1973

;

9

:

245

8

.

Watts
D.M.

,

Leduk
J.W.

,

Bailey
CL

,

Dalrymple
JM

,

Gargan
TP

II.

dowody serologiczne Kanionu Jamestown i infekcji wirusowej Keystone u kręgowców Półwyspu Delmarva

.

Am J Trop Med Hyg
1982

;

31

:

1245

51

.

Watts
DM

,

Bailey
CL

,

Roberts
NT

,

Tammariello
RF

,

Dalrymple
jm

,

Clark
GK

.

Ochrona i przenoszenie wirusa Keystone Aedes atlanticus (Diptera: Culicidae) i szarej wiewiórki w cyprysowym Bagnie Pokomok, Maryland

.

J Med Entomol
1988

;

25

:

493

500

.

Parkin
my

,

Hammon
WM

,

Sater
GE

.

przegląd aktualnej literatury epidemiologicznej na temat wirusów grupy arbowirusów kalifornijskich

.

am Jay trop med Hig
1972

;

21

:

964

78

.

Lednicki
J

,

Bo de Rochard
vm

,

Elbadri
m

i in.

wybuch wirusa Zika na Haiti W 2014 roku: molekularny i dane kliniczne

.

PLOS Negl Trop Dis
2016

;

10

:

e0004687

.

de Morais Bronzoni
RV

,

Baleotti
FG

,

Ribeiro Nogueira
RM

,

Nunes
m

,

Moraes Figueiredo
lt

.

dupleksowa odwrotna transkrypcja-PCR, a następnie zagnieżdżona analiza PCR w celu wykrycia i identyfikacji brazylijskich alfawirusów i flawiwirusów

.

J Blink Microbiol
2005

;

43

:

696

702

. ©Autor (y) 2018. Opublikowane przez Oxford University Press dla Infectious Diseases Society of America. Wszelkie prawa zastrzeżone. W sprawie uprawnień, e-mail: [email protected]

ten artykuł jest publikowany i dystrybuowany na warunkach Oxford University Press, Standard Journals Publication Model (https://academic.oup.com/journals/pages/open_access/funder_policies/chorus/standard_publication_model)

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.