zoptymalizowana oczyszczona inaktywowana szczepionka Zika zapewnia trwałą immunogenność i ochronę w szczepionkach cynomolgus macaques

preparaty szczepionki ZPIV i zpiv-SP

kandydat do ZPIV (faza I seria kliniczna) został dostarczony przez WRAIR16. Szczepionkę dostarczano w postaci płynnej, gotowej do wstrzykiwań, w dawce 5 µg białek na dawkę (500 µL), co odpowiada 200 jednostkom antygenowym (AU), sformułowanym z AlOOH. Zoptymalizowana szczepionka (ZPIV-SP) została przygotowana w firmie Sanofi Pasteur (Marcy L ’ Etoile, Francja) przy użyciu procesu WRAIR jako punktu wyjścia z następującymi ulepszeniami. Krótko mówiąc, po początkowej amplifikacji ZIKV-PR w komórkach Sanofi Pasteur Vero, wirusowy RNA ekstrahowano i transfekowano do komórek Vero wolnych od surowicy (Spsf) Sanofi Pasteur. Odzyskany wirus Amplifikowano, dwukrotnie oczyszczono płytkę nazębną i dalej Amplifikowano w celu wytworzenia partii nasion przed-Master, z której uzyskano partię nasion Master i działającą partię nasion. Wirus został wyprodukowany w bioreaktorze o pojemności 180 L z wykorzystaniem komórek SPSF Vero. Następnie wirus został wyjaśniony, oczyszczony przez ultracentryfugację ze zmodyfikowanym odcięciem i chromatografią i inaktywowany przez obróbkę formaliną. Parametry etapów oczyszczania i inaktywacji zostały zoptymalizowane w porównaniu z warunkami stosowanymi przez WRAIR. Produkt leczniczy dostosowano ELISA do zawartości antygenowej koperty ZIKV (E) do 400 AU/mL (co odpowiada 10 µg/mL białek ZPIV) i liofilizowano. Liofilizowaną szczepionkę dostosowano do 100, 200 lub 400 AU na dawkę (500 µL) i zawieszono w żelu AlOOH (500 µg/dawkę—Biosektor Brenntag, Dania). En zdefiniowano jako zawartość antygenową obwiedni (Env) mierzoną metodą ELISA.

schemat szczepień

cztery grupy po 6 samców makaków cynomolgus (Macaca fascicularis-Noveprim), w wieku 2 lat, otrzymały 500 µL ZPIV pierwszej generacji (Grupa A: 200 AU) lub zoptymalizowanego ZPIV – SP (grupa B: 100 AU, Grupa C: 200 AU lub grupa D: 400 AU) domięśniowo (IM) w prawym czworogłowie w dniu 0 (D0) i w lewym czworoboku na D28. Sześć miesięcy później (D176) sześć makaków z grupy B, które otrzymały 100 AU ZPIV-SP, otrzymało dawkę przypominającą o tej samej postaci i było obserwowanych przez 6 miesięcy (Fig. 1). Pozostałe grupy wykorzystywano do walki z wirusami.

monitorowanie kliniczne

natychmiastowe reakcje obserwowano w ciągu 30 minut, a potencjalne reakcje miejscowe w miejscu wstrzyknięcia obserwowano przez 7 dni po każdej immunizacji. Makaki były monitorowane codziennie, a objawy takie jak zmniejszone spożycie pokarmu, ograniczona mobilność, polipnea, reakcje miejscowe i ogólnoustrojowe były rejestrowane w całym badaniu. Masę ciała i temperaturę ciała (przy użyciu chipów transpondera) rejestrowano na początku badania i w regularnych odstępach czasu.

pobieranie próbek krwi po immunizacji w celu oceny immunogenności

surowice pobrano w różnych punktach czasowych w ciągu 6 miesięcy po podaniu 1 i 2 dawki (od D0 do D164) i po wzmocnieniu dla grupy B (od D15 do D170) w celu oceny odpowiedzi humoralnych, w tym przeciwciał neutralizujących ZIKV metodą MN50 i swoistych dla ZIKV IgG metodą ELISA.

PBMC zebrano w punkcie wyjściowym, D7, D35, D90 i D164 w celu oceny odporności komórkowej i odpowiedzi komórek B z pamięcią.

wyzwanie z ZIKV-PR typu dzikiego

pięć miesięcy po podaniu drugiej dawki (D176) makakom z grup A, C, D i sześciu makakom nieleczonym (Grupa E: kontrola pozorowana) poddano wyzwanie 105 jednostkami formowania płytki nazębnej (PFU rozcieńczonym w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)) wt-ZIKV-PR (szczep PRVABC59 z CDC) poprzez wstrzyknięcie podskórne (SC) w okolicę mięśnia naramiennego prawego ramię i pod znieczuleniem (zoletil®) (rys. 1). Dawka prowokacyjna I DROGA PODANIA zostały dobrane na podstawie wyników poprzedniego badania (wyniki niepublikowane).

próbki biologiczne pobierane po prowokacji

osocze pobierano codziennie przez 7 dni, a po prowokacji D9 i D15 do testów wirusologicznych. CSF (100-300 µL) Pobrano z Cisterna magna na D7, D15 i D28 po prowokacji. Brak zanieczyszczenia krwi w płynie mózgowo-rdzeniowym potwierdzono poprzez oględziny, a próbki przechowywano w temperaturze -80 °C. ślinę pobierano codziennie przez 15 dni, a płyny do oczu pobierano wymazem z komórek D7 i D15 po prowokacji. Wymazy umieszczano później w probówkach zawierających 500 µL RNA (Invitrogen, USA) i mieszano przez wir. Wymazy następnie odrzucano, a eluaty przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu analizy.

do testów immunologicznych osocze pobierano w wielu punktach czasowych od D15 do D112, a PBMCs pobierano na D35 i D112.

wiremia i wiremia w płynach biologicznych po prowokacji

ZIKV RNA w osoczu, ślinie, płynie ocznym i płynie mózgowo-rdzeniowym z grup A, C, D i E oznaczono ilościowo po prowokacji przy użyciu qRT-PCR ukierunkowanego na geny NS522. Całkowity genomowy RNA został najpierw wyekstrahowany z próbek za pomocą zestawu wirusa Macherey Nagel nucleospin® 96 (Macherey Nagel, Niemcy) na zautomatyzowanej stacji roboczej ekstrakcji RNA Tecan Evoware zgodnie z instrukcjami producenta i eluowany w wodzie wolnej od nukleaz.

Sandwich ELISA do oznaczenia ilościowego antygenu ZIKV NS1

resztkową zawartość antygenu ZIKV ns1 oznaczono metodą sandwich ELISA w preparacie wirusa użytym do prowokacji. Mierzono również w nierozcieńczonych i rozcieńczonych (1:30) próbki osocza pobrane na początku badania, D1, D2, D3, D4 i D5 ze wszystkich badanych grup jako metoda pośrednia oceny replikacji wirusa.

krótko, 96-studzienkowe płytki ELISA pokryto mysim przeciwciałem monoklonalnym swoistym dla białka ZIKV NS1 (klon B-J5 r & D Biotech, Francja) W soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1 × (PBS). Miejsca niezwiązane były następnie blokowane przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C za pomocą PBS-Tween20 w 1% mleku (PBS-Tw-M). Płytki przemyto PBS-Tween20 między etapami inkubacji. Próbki testowe rozcieńczono seryjnie dwukrotnie w PBS-Tw-M i inkubowano w studzienkach przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. dodano drugi koniugat monoklonalnej peroksydazy chrzanowej (HRP) skierowanej do białka ZIKV ns1 (klon B-M6 r&D Biotech, Francja) i inkubowano przez 90 minut w temperaturze 37 °C. Następnie płytki inkubowano w ciemności przez 45 minut w temperaturze 37 ° C. Temperatura pokojowa (RT) z gotowym do użycia substratem tetrametylobenzydyny (tebu-bio Laboratories, Francja). Reakcje przerwano po podaniu 1 N HCl (VWR Prolabo). Gęstość optyczną (OD) mierzono przy 450-650 nm za pomocą automatycznego czytnika płyt. Rekombinowane białko ZIKV NS1 (natywny antygen, UK) zostało użyte do ustalenia krzywej standardowej w celu określenia zawartości NS1 w próbkach testowych. Stężenie białka określono jako średnią wszystkich indywidualnych stężeń dla zakresu wartości OD od 0,2 do 3,0. Granica wykrywalności (LOD) testu wynosiła 5 ng/mL.

testy immunologiczne

IgG swoiste dla kopert i NS1

IgG swoiste dla kopert i NS1 oceniano metodą ELISA na 96 – studzienkowych płytkach pokrytych rekombinowanym białkiem E (Meridian Life Science Inc. Memphis, USA) lub rekombinowane białko niestrukturalne 1 (NS1) (Native Antigen Company, Oxford, UK) w buforze węglanowym, pH 9,6. Po zablokowaniu mlekiem PBS-Tween20 przez 60 minut w temperaturze 37 °C, dodano dwie rozcieńczone próbki surowicy i inkubowano przez 90 minut w temperaturze 37 °C. etapy mycia przeprowadzono między etapami inkubacji z PBS-Tween. Dodano koniugat koziego przeciw małpom IgG HRP (Ref Aai42p, BIO-RAD, Francja) rozcieńczony w PBS-Tw-M w temperaturze 1:5000 i inkubowano przez kolejne 90 minut w temperaturze 37 °C przed rozwojem koloru z substratem tetrametylobenzydyny (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, Francja). Gęstość optyczną mierzono przy 450-650 nm za pomocą automatycznego czytnika płyt. Miana IgG swoistych dla E obliczono za pomocą referencyjnej krzywej regresji surowicy małp anty-ZIKV. Miana IgG swoistych dla NS1 obliczono jako wzajemne rozcieńczenie surowicy, dając gęstość optyczną 1 przy użyciu funkcji tendencji. Miano odniesienia obliczono wcześniej jako średnią z kilku oznaczeń wzajemnego rozcieńczenia, dającą gęstość optyczną 1,0. Wszystkie miana wyrażono w log10 jednostkach ELISA (EU). LOD ustalono na 1,3 log10 EU, a do każdego miana poniżej LOD przypisano dowolne miano 1,0 log10.

przeciwciała neutralizujące ZIKV

do pomiaru specyficznych dla ZIKV przeciwciał neutralizujących zastosowano wysokoprzepustowy test ZIKV MN5022. Krótko, surowice inaktywowane Cieplnie rozcieńczano seryjnie, mieszano z ZIKV-PR i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 75 minut. Następnie mieszaniny przeniesiono do 96-studzienkowych płyt zawierających monowarstwy łączące komórki Vero. Po inkubacji przez 5 dni zakażone komórki zabarwiono biotynylowanym Pan-flawiwirusem 4G2 mAb (Hb112, Biotem, Francja) i wizualizowano 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanem/tetrazolium nitro blue w substracie lewamizolu. Studnie dodatnie definiowano jako wykryte przynajmniej jedno kolorowe ognisko zakaźne. Dla każdego rozcieńczenia zarejestrowano całkowitą liczbę ujemnych studzienek i obliczono wzajemne rozcieńczenie odpowiadające 50% neutralizacji wirusa metodą najmniejszego kwadratu i wyrażono jako miano log10 MN50 neutralizacji.

Test Immunospot (ELISpot) z pamięcią limfocytów B

zakonserwowane Krio PBMC szybko rozmrażano w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do PBMCs powoli dodawano mieszaninę płodowej surowicy cielęcej (FCS) / DNazy (100 µg/mL), a następnie przenoszono do rpmic (rpmi/10% FCS/glutamina/koktajl antybiotykowy). Po 1 godz. w temperaturze 37 °C PBMC liczono za pomocą zestawu Viacount Guava, zgodnie z instrukcjami producenta. PBMC zawieszono w 1 × 106 komórek/mL w poliklonalnym ośrodku stymulacyjnym zawierającym RPMIc z R848 (resiquimod) w 1 µg/mL i IL-2 w 10 ng/mL (oba z Mabtech) i inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 dni, aby umożliwić różnicowanie komórek B pamięci w komórki wydzielające przeciwciała (ASC)37.

sterylne 96-studzienkowe płytki Multiscreen-IP z membranami PVDF (Millipore) wstępnie inkubowano z 35 µL 35% etanolu, a następnie przemyto trzy razy sterylnym PBS 1X, a następnie pokryto 100 µL ludzkiego przeciwciała anty-IgG (klon Mabtech 3850-3-1000) w celu wykrycia całkowitych komórek wydzielających IgG lub cząstek wirusopodobnych (VLP) ZIKV lub ns1 ZIKV (klon Mabtech 3850-3-1000). native antigen company, Wielka Brytania). Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przemyto trzy razy sterylnym 1x PBS i nasycono pożywką RPMIc przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie usunięto podłoże RPMIc i dodano PBMC w 2500 i 5000 komórkach w studzienkach wychwytowych pokrytych przeciwciałami oraz w 200 000 i 400 000 komórkach w studzienkach ZIKV prM/Env VLP lub ZIKV NS1 pokrytych podłożem RPMIC. Każdy warunek testowano w trzech egzemplarzach i płytki inkubowano przez 20 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2.

płytki przemyto dwukrotnie w PBS/Tween 20 (0,05%) i trzykrotnie w PBS i inkubowano z biotynylowanym anty-ludzkim IgG Ab (klon MABTECH MT78/145-biotyna, Szwecja) w dawce 1 µg /mL w PBS 1 × / 0,5% BSA w RT przez 1,5 godziny. Następnie płytki przemyto pięć razy w PBS i dodano streptawidynę znakowaną fikoerytryną (Sigma, Francja) rozcieńczoną w stosunku 1:100 z 0,5% PBS/BSA. Płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto sześć razy PBS, wysuszono i trzymano w ciemności. Tablice odczytano czytnikiem HLW20 (Microvision Instrument) za pomocą oprogramowania IRIS i analizowano za pomocą oprogramowania Cosmic. Wyniki są wyrażone jako odsetek specyficznych dla antygenu ASC wśród całkowitych ASC IgG.

testy Elispota komórek T

odpowiedzi immunologiczne swoiste dla komórek T ZIKV oceniano za pomocą testów Elispota IFNy i IL-5 z wykorzystaniem puli peptydów 15-aminokwasowych (aa) z 11 nakładkami aa obejmującymi białka Env, prM i kapsyd ZIKV (JPT, Niemcy). Krótko mówiąc, 96-studzienkowe płytki Multiscreen-IP z membranami PVDF (Millipore) poddano wstępnej obróbce 35% etanolem, a następnie powleczono przez noc w temperaturze 4 °C 100 µL/studzienkę anty-Małpiego/ludzkiego IFNy (klon MABTECH MT126L) lub anty-ludzkiego IL-5 (klon MABTECH TRFK5) w dawce 10 µg/mL w sterylnym PBS 1×. Po zablokowaniu RPMIc (rpmi/10% FCS/glutamina/koktajl antybiotykowy), 3 × 105 rozmrożonych PBMC inkubowano w trzech egzemplarzach z 2 µg / mL każdego peptydu ZIKV lub nieistotną pulą peptydów (Kontrola negatywna) w obecności anty-CD28 (mAb CD28.2) i anty-CD49d (mAb 9f10) z Biolegend jako Ko-stymulatory. Jako kontrolę pozytywną zastosowano stymulację PHA (Remel)/PMA (SIGMA). Po 18-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C płytki przemyto w PBS-BSA 0.5% i inkubowano z biotynylowaną Przeciwludzką IFNy (klon Mabtech 7-B6-1) lub biotynylowaną PRZECIWLUDZKĄ IL-5 (Klon mabtech 5a10) w dawce 1 µg/mL, poniżej 100 µL/studzienkę, przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności. Po umyciu płytki inkubowano następnie ze streptawidyną-PE (Biotech Południowy) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności, a następnie sześć myć w PBS-BSA 0,5%.

tablice odczytano czytnikiem HLW20 (Microvision Instrument) za pomocą oprogramowania IRIS i przeanalizowano za pomocą oprogramowania Cosmic. Wyniki wyrażono jako liczbę komórek plamistych IFNy lub IL-5 (SFC) na 106 PBMC.

Metody statystyczne

wszystkie dane zostały przekształcone w log przed analizą statystyczną. Od D0 do D164 analizy odpowiedzi humoralnych przeprowadzono przy użyciu podłużnego modelu analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami w różnych punktach czasowych dla każdej małpy. Efekt czasu był modelowany za pomocą efektu kwadratowego. Do modelowania efektów challenge i boost wykorzystano Podłużny model analizy wariancji dla każdego odczytu. Dla każdej małpy w modelu uwzględniono powtarzające się pomiary w różnych punktach czasowych. Tukey lub Dunnett korekty przeprowadzono dla wielu porównań.

dla odporności komórkowej porównano grupy lub punkty czasowe za pomocą jednokierunkowego ANOVA lub za pomocą modelu podłużnego w zależności od kwestii biologicznej.

wszystkie analizy zostały wykonane przy użyciu oprogramowania SAS® v9.4 na poziomie Alfa 0,05. Wartości p niższe od tej wartości wskazywały na statystycznie istotne różnice.

względy etyczne

wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z akredytowanymi obiektami dla zwierząt Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, zgodnie z Dyrektywą Europejską 2010/63 i francuskimi przepisami krajowymi. Protokoły zostały zatwierdzone przez Sanofi Pasteur Ethical Committee for Animal Experimentation.

makaki, które zostały użyte w badaniu challenge, poddano humanitarnej eutanazji pod koniec badania (4 miesiące po prowokacji) ze względu na bezpieczeństwo biologiczne, ponieważ ZIKV jest sporadycznie utrzymujący się u makaków30. Zwierzęta użyte do badania booster zostały ponownie wykorzystane w innych eksperymentach badawczych.

Podsumowanie Raportu

Więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu raportu Przyrodniczego połączonym z tym artykułem.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.