otimizado de Um purificada inativada Zika vacina fornece sustentado imunogenicidade e proteção em macacos cinomolgos

ZPIV e ZPIV-SP formulações de vacinas

O ZPIV candidato (fase I clínica lote) foi fornecida pela WRAIR16. A vacina foi fornecida em forma líquida, pronta para injecção, a 5 µg de proteínas por dose (500 µL), correspondendo a 200 unidades antigénicas (AU), formuladas com AlOOH. A vacina optimizada (ZPIV-SP) foi preparada na Sanofi Pasteur (Marcy L’Etoile, França) utilizando o processo WRAIR como ponto de partida com as seguintes melhorias. Brevemente, após a amplificação inicial de ZIKV-PR nas células da Sanofi Pasteur Vero, o ARN viral foi extraído e transfectado para as células Vero sem soro da Sanofi Pasteur (SPSF). O vírus recuperado foi amplificado, purificado em placas duas vezes e amplificado para gerar um lote de sementes pré-mestre do qual um lote de sementes Mestre e um lote de sementes de trabalho foram derivados. O vírus foi produzido em um biorreator de 180 L usando células SPSF Vero. O vírus foi então clarificado, purificado por ultracentrifugação com um corte modificado e cromatografia, e inactivado por tratamento com formalina. Os parâmetros das etapas de purificação e inactivação foram otimizados em comparação com as condições utilizadas pelo WRAIR. O medicamento foi ajustado para o conteúdo antigénico do Envelope (E) do ZIKV por ELISA para 400 AU/mL (correspondente a 10 µg/mL de proteínas ZPIV) e liofilizado. A vacina liofilizada foi ajustada para 100, 200 ou 400 AU por dose (500 µL) e ressuspendida num gel AlOOH (500 µg/dose—Biosector Brenntag, Dinamarca). AU foi definido como o conteúdo antigénico do envelope (Env) medido por ELISA.

de Vacinação agenda

Quatro grupos de seis flavivírus-negativo masculino macacos cinomolgos (Macaca fascicularis – Noveprim), de 2 anos de idade, recebeu 500 µL da primeira geração de ZPIV (grupo A: 200 AU) ou otimizado ZPIV-SP (grupo B: 100 UA, grupo C: 200 AU ou grupo D: 400 AU) por via intramuscular (IM) no direito do quadríceps no dia 0 (D0) e na esquerda do quadríceps em D28. Seis meses depois (D176), os seis macacos do grupo B que receberam 100 AU de ZPIV-SP, receberam uma dose de reforço da mesma formulação e foram seguidos durante 6 meses (Fig. 1). Os outros grupos foram usados para o desafio viral.

monitorização clínica

foram observadas reacções imediatas no espaço de 30 minutos e foram observadas potenciais reacções locais no local da injecção nos 7 dias seguintes a cada imunização. Os macacos foram monitorados todos os dias e sintomas como diminuição da ingestão de alimentos, mobilidade restrita, polipnea, reações locais e sistêmicas foram registrados ao longo do estudo. O peso corporal e a temperatura corporal (utilizando chips de transponder) foram registados na linha de base e a intervalos regulares ao longo do estudo.

de coleta de Sangue pós-imunização para a imunogenicidade de avaliação

Soros foram coletados em diferentes pontos, mais 6 meses de pós-dose 1 e 2 (D0 a D164) e pós-impulso para o grupo B (D15 para D170) para avaliar as respostas humorais, incluindo ZIKV anticorpos neutralizantes por um MN50 ensaio e ZIKV Env e NS1-específicos IgG por ELISA.

PBMCs foram recolhidos no início, D7, D35, D90 e D164 para avaliar a imunidade mediada por células celulares e as respostas das células B de memória.

Desafio com o tipo selvagem ZIKV-PR

Cinco meses de pós-dose 2 (D176), os macacos para os grupos A, C, D, e seis ingênuo macacos (grupo E: sham (controle) foram desafiados com 105 unidades formadoras de placa (UFP diluído em phosphate-buffered saline (PBS) do wt-ZIKV-PR (strain PRVABC59 do CDC), por via subcutânea (SC) injeção na região deltóide do braço direito, e sob anestesia (Zoletil®) (Fig. 1). A dose e a via de recurso foram seleccionadas com base nos resultados de um estudo anterior (resultados não publicados).as amostras biológicas pós-provocação foram recolhidas diariamente durante 7 dias e em D9 E D15 pós-provocação para os ensaios virológicos. O LCR (100-300 µL) foi recolhido do cisterna magna Em D7, D15 e D28 pós-desafio. A ausência de contaminação do sangue no líquido cefalorraquidiano foi confirmada através de inspecção visual e as amostras foram armazenadas a -80 °C. A Saliva foi colhida todos os dias durante 15 dias e os fluidos oculares foram colhidos com um esfregaço em D7 E D15 após o teste. Os esfregaços foram colocados em tubos contendo 500 µL de ARN posteriormente (Invitrogen, EUA) e misturados por vórtice. Os esfregaços foram então descartados, e os eluídos foram armazenados a -80 °C até serem analisados.

para os ensaios imunológicos, o plasma foi colhido em vários pontos temporais entre D15 e D112 e as células Cdsp foram recolhidas em D35 e D112.

Virose e cargas virais em fluidos biológicos pós-desafio

ZIKV RNA no plasma, saliva, fluido ocular e CSF amostras dos grupos A, C, D, e e foi quantificada pós-desafio usando um trim-PCR visando o NS5 gene22. O RNA genómico Total foi primeiramente extraído de amostras com um kit de vírus Macherey Nagel NucleoSpin® 96 (Macherey Nagel, Alemanha) em uma estação de trabalho automatizada de extração de RNA Tecan Evoware de acordo com as instruções do fabricante e eluído em água sem nucleases.o teste ELISA em sanduíche para quantificar o antigénio ZIKV NS1

o teor Residual do antigénio ZIKV NS1 foi quantificado por um teste ELISA em sanduíche na preparação do vírus utilizada para a provocação. Foi também medido em não diluído e diluído (1:30) amostras de plasma colhidas no início, D1, D2, D3, D4 e D5 de todos os grupos desafiados, como método indirecto para avaliar a replicação viral.

revemente, as placas ELISA de 96 alvéolos foram revestidas com um anticorpo monoclonal específico do rato para a proteína ZIKV NS1 (clone B-J5 R&d Biotech, França) em solução salina tampão de fosfato 1 × (PBS). Os sítios não vinculados foram então bloqueados durante 1 h a 37 ° C com PBS-Tween20 em 1% de leite (PBS-Tw-M). As placas foram lavadas com PBS-Tween20 entre os passos de incubação. Teste amostras foram diluídas serialmente para o dobro em PBS-Tw-M e incubadas em poços por 1 h a 37 °C. Um segundo anticorpo monoclonal de rato peroxidase de rábano (HRP)-conjugado direcionado para ZIKV proteína NS1 (clone B-M6 R&D Biotech, França) foi adicionado e incubado por 90 min a 37 °C. em Seguida, as placas foram incubadas no escuro por 45 min em temperatura ambiente (RT) com um pronto-para-usar Tetrametilbenzidina (Tebu-Bio Laboratórios, França) substrato. As reacções foram interrompidas com HCl 1 N (VWR Prolabo). A densidade óptica (do) foi medida a 450-650 nm com um leitor automático de placas. Foi utilizada uma proteína recombinante ZIKV NS1 (antigénio nativo, Reino Unido) para estabelecer uma curva padrão para determinar o teor de NS1 das amostras de ensaio. A concentração proteica foi determinada como a média de todas as concentrações individuais para o valor da do de 0, 2 a 3, 0. O limite de detecção (LD) do ensaio foi de 5 ng/mL.os ensaios imunológicos

Envelope – e IGGS específicas para NS1

nvelope-e IgGs específicas para NS1 foram avaliados por ELISA em 96 placas bem revestidas com proteína e recombinante (Meridian Life Science Inc., Memphis, EUA) ou proteína recombinante não estrutural 1 (NS1) (Native Antigen Company, Oxford, Reino Unido) em tampão carbonatado, pH 9.6. Após bloqueio com leite PBS-Tween20 – durante 60 minutos a 37 ° C, adicionaram-se duas amostras de soro diluído e incubaram-se durante 90 minutos a 37 °C. procedeu-se à Lavagem entre as fases de incubação com PBS-Tween. Adicionou-se um conjugado de HRP de cabra anti-macaco IgG (Ref AAI42P, BIO-RAD, França) diluído em PBS-Tw-M a 1:5000 e incubou-se durante mais 90 minutos a 37 °C antes do desenvolvimento de cores com substrato de tetrametilbenzidina (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, França). A densidade óptica foi medida a 450-650 nm com um leitor automático de placas. Os títulos de IgGs específicas para o e foram calculados utilizando uma curva de regressão sérica de referência do macaco anti-ZIKV. Os títulos de IgGs específicas para NS1 foram calculados como a diluição recíproca do soro dando uma densidade óptica de 1 usando a função de tendência. O título da referência foi previamente calculado como a média de várias determinações da diluição recíproca, dando uma densidade óptica de 1,0. Todos os títulos foram expressos em log10 unidades ELISA (UE). O LOD foi definido em 1, 3 log10 EU e um título arbitrário de 1, 0 log10 foi atribuído a cada título abaixo do LOD.foi utilizado um doseamento de ZIKV MN50 de alta capacidade para medir os antibodies neutralizantes específicos do ZIKV22. Brevemente, os soros inactivados pelo calor foram diluídos em série, misturados com ZIKV-PR e incubados a 37 °C durante 75 minutos. As misturas foram então transferidas para placas de 96 poços contendo camadas confluentes de células Vero. Após incubação durante 5 dias, as células infectadas foram manchadas com pan-flavivirus 4G2 mAb biotinilado (HB112, Biotem, França) e visualizadas com 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/nitro blue tetrazolium no substrato do levamisol. Poços positivos foram definidos como pelo menos um foco infeccioso colorido detectado. Para cada diluição, registou-se o número total de alvéolos negativos e a diluição recíproca correspondente a 50% da neutralização viral foi calculada utilizando o método menos quadrado e expressa como título de neutralização log10 MN50.os PBMC Criogenados foram rapidamente descongelados num banho de água a 37 ° C. Uma mistura de soro de feto de vitelo (CPF) / DNAse (100 µg/mL) foi lentamente adicionada às CPSP, antes de ser transferida para o RPMIc (RCPMI/10% CVS/glutamina/antibiótico cocktail). Após 1 h a 37 ° C, As CPSP foram contadas utilizando o Kit De Goiaba ViaCount de acordo com as instruções do fabricante. As PBMCs foram em suspensão em 1 × 106 células/mL em estimulação policlonal meio contendo RPMIc com R848 (resiquimod) em 1 µg/mL) e IL-2, com 10 ng/mL (ambos de Mabtech) e incubadas a 37 °C com 5% de CO2 por 4 dias para permitir a diferenciação de células B de memória em anticorpos, células secretoras (ASC)37.

Estéril de 96 poços Multiscreen-IP placas com membranas de PVDF (Millipore) foram pré-incubadas com 35 µL de 35% de etanol e, em seguida, lavadas três vezes com PBS estéril 1X antes de ser revestido com 100 µL de anti-IgG humana de anticorpos (Mabtech clone 3850-3-1000) para detectar IgG total da secreção de células ou pré-membrana e envelope (prM/Env) vírus-como partículas (VLP) ZIKV ou NS1 ZIKV (Nativo Antigen Empresa, reino UNIDO). As placas foram incubadas durante a noite a 4 ° C e, em seguida, lavadas três vezes com 1X PBS estéril e saturadas com meio Rpmico durante 2 h a 37 ° C. RPMIc meio foi removido e PBMCs foram adicionados em 2500 e 5000 células revestidos com anticorpos de captura de poços, e em 200.000 e 400.000 células no ZIKV prM/Env VLP ou ZIKV NS1-o revestimento dos poços, em RPMIc médio. Cada condição foi testada em triplicado e as placas foram incubadas durante 20 h a 37 °C com 5% de CO2.

As placas foram lavadas duas vezes em PBS/Tween 20 (0,05%), o três vezes com PBS e incubadas com um biotinilado anti-IgG humano Ab (Mabtech clone MT78/145-Biotina, Suécia) em 1 µg/mL em PBS 1 × /0,5% DE BSA no RT por 1,5 h. As placas foram lavadas cinco vezes em PBS, e a estreptavidina marcada com phycoerythrina (Sigma, França) diluída 1:100 com 0,5% PBS/BSA foi adicionada. As placas foram incubadas por 1 h na TR, depois lavadas seis vezes com PBS, secas e mantidas no escuro. As placas foram lidas com o hlw20 reader (instrumento Microvision) usando o software IRIS e analisadas com o software cósmico. Os resultados são expressos em percentagem de ASCs específicas aos antigénios entre as ASCs totais das IgG.as respostas imunitárias específicas das células T foram avaliadas pelos ensaios IFNy e IL-5 ELISpot utilizando conjuntos de peptídeos de 15 aminoácidos (aa) com 11 sobreposições aa cobrindo as proteínas Env, prM e Capsid ZIKV (JPT, Alemanha). Brevemente, 96-bem Multiscreen-IP placas com membranas de PVDF (Millipore) foram pré-tratados com 35% de etanol e, em seguida, revestido durante a noite a 4 °C, com 100 µL/poço de anti-macaco/humanos IFNy (Mabtech clone MT126L) ou anti-humano, IL-5 (Mabtech clone TRFK5) a 10 µg/mL em PBS estéril 1×. Após o bloqueio com RPMIc (RPMI/10% FCS/Glutamina/antibiótico cocktail), 3 × 105 descongelado PBMCs foram incubadas em triplicado, com 2 µg/mL de cada ZIKV peptídeos ou irrelevante peptídeo piscina (controlo negativo), na presença de anti-CD28 (mAb CD28.2) e anti-CD49d (mAb 9F10) a partir de Biolegend como co-estimuladores. A estimulação PHA (Remel)/PMA (SIGMA) foi utilizada como controlo positivo. Após uma incubação de 18-h a 37 ° C, As placas foram lavadas em PBS-BSA 0.5% e incubados com IFNy anti-humano biotinilado (Mabtech clone 7-B6-1) ou il-5 anti-humano biotinilado (Mabtech clone 5A10) a 1 µg/mL, com menos de 100 µL/alvéolo, durante 2 h na TR, no escuro. Após a lavagem, as placas foram subsequentemente incubadas com streptavidin-PE (Southern Biotech) durante 1 h na TR, no escuro, seguido de seis lavagens em PBS-BSA 0,5%.

As placas foram lidas com o leitor HLW20 (instrumento Microvision) usando o software IRIS e analisadas com o software cósmico. Os resultados foram expressos como o número de células formadoras de manchas tipo IFNy ou IL-5 (CFT) por 106 CPSP.

métodos estatísticos

todos os dados foram transformados logicamente antes de análises estatísticas. De D0 a D164, as análises das respostas humorais foram realizadas usando um modelo longitudinal de análise de variâncias com medições repetidas em diferentes pontos temporais para cada macaco. O efeito do tempo foi modelado usando um efeito quadrático. Para modelar os efeitos de desafio e impulso, foi utilizado um modelo longitudinal de análise da variância para cada leitura. Para cada macaco, medições repetidas em diferentes pontos temporais foram tidas em conta no modelo. Ajustes de Tukey ou Dunnett foram realizados para comparações múltiplas.para a imunidade mediada por células, as comparações entre grupos ou pontos temporais foram feitas por uma ANOVA de Sentido Único ou usando um modelo longitudinal dependendo da questão biológica.todas as análises foram realizadas utilizando software SAS® v9. 4 a um nível alfa de 0,05. Valores de P inferiores a este valor indicaram diferenças estatisticamente significativas.considerações éticas todas as experiências com animais foram realizadas em conformidade com a Associação para a avaliação e Acreditação de instalações acreditadas para cuidados laboratoriais com animais, em conformidade com a Diretiva Europeia 2010/63 e com a regulamentação nacional francesa. Os protocolos foram aprovados pelo Comité ético Sanofi Pasteur para a experimentação Animal.os macacos utilizados no estudo challenge foram eutanasiados humanamente no final do estudo (4 meses após o desafio) por razões de biossegurança, já que ZIKV foi relatado ser ocasionalmente persistente no macaques30. Os animais utilizados no estudo de reforço foram reutilizados noutras experiências de investigação.o resumo dos Relatórios de investigação sobre a natureza ligado a este artigo contém mais informações sobre a concepção da investigação.

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