Un vaccin Zika inactivat purificat optimizat asigură imunogenitate și protecție susținută în formulările vaccinului cynomolgus macaques

zpiv și zpiv-SP

candidatul ZPIV (lotul Clinic de fază I) a fost furnizat de WRAIR16. Vaccinul a fost furnizat într-o formă lichidă, gata pentru injectare, la 5 hectolitri de proteine per doză (500 centil), corespunzând la 200 unități antigenice (UA), formulate cu AlOOH. Vaccinul optimizat (ZPIV-SP) a fost preparat la Sanofi Pasteur (Marcy l ‘ Etoile, Franța) folosind procesul WRAIR ca punct de plecare cu următoarele îmbunătățiri. Pe scurt, după amplificarea inițială a ZIKV-PR în celulele Vero Sanofi Pasteur, ARN-ul viral a fost extras și transfectat în celulele Vero fără ser ale Sanofi Pasteur (SPSF). Virusul recuperat a fost amplificat, purificat de placă de două ori și amplificat în continuare pentru a genera un lot de semințe pre-Master din care au fost derivate un lot de semințe de Master și un lot de semințe de lucru. Virusul a fost produs într-un bioreactor de 180 l folosind celule Spsf Vero. Virusul a fost apoi clarificat, purificat prin ultracentrifugare cu o întrerupere și cromatografie modificată și inactivat prin tratamentul cu formalină. Parametrii etapelor de purificare și inactivare au fost optimizați în comparație cu condițiile utilizate de WRAIR. Produsul medicamentos a fost ajustat pentru conținutul antigenic al plicului ZIKV (E) de către ELISA la 400 AU/mL (corespunzând la 10 hectogg/mL de proteine ZPIV) și liofilizat. Vaccinul liofilizat a fost ajustat la 100, 200 sau 400 UA per doză (500 xqtl) și omogenizat într—un gel AlOOH (500 xqtg/doză-Brenntag Biosector, Danemarca). AU a fost definit ca conținutul antigenic al învelișului (Env) măsurat prin ELISA.

schema de vaccinare

patru grupuri de șase flavivirus-negativ macaci cynomolgus masculi (Macaca fascicularis – Noveprim), în vârstă de 2 ani, au primit 500 unqql de zpiv de primă generație (grupa A: 200 AU) sau zpiv-SP optimizat (grupa B: 100 AU, grupa C: 200 AU sau grupa D: 400 AU) intramuscular (IM) în cvadricepsul drept în ziua 0 (D0) și cvadricepsul stâng pe D28. Șase luni mai târziu (D176), cei șase macaci din grupul B care au primit 100 UA de ZPIV-SP, au primit o doză de rapel din aceeași formulare și au fost urmăriți timp de 6 luni (Fig. 1). Celelalte grupuri au fost folosite pentru provocarea virală.

monitorizare clinică

reacțiile imediate au fost observate în decurs de 30 de minute și reacțiile locale potențiale la locul injectării au fost observate pe parcursul celor 7 zile de la fiecare imunizare. Macacii au fost monitorizați în fiecare zi și au fost înregistrate simptome precum scăderea aportului alimentar, mobilitate limitată, polipnee, reacții locale și sistemice pe tot parcursul studiului. Greutatea corporală și temperatura corporală (utilizând cipuri transponder) au fost înregistrate la momentul inițial și la intervale regulate pe tot parcursul studiului.

prelevarea de probe de sânge post-imunizare pentru evaluarea imunogenității

serurile au fost colectate în diferite momente de timp pe parcursul a 6 luni post-doza 1 și 2 (D0 până la D164) și post-boost pentru grupul B (D15 până la D170) pentru a evalua răspunsurile umorale, inclusiv anticorpii neutralizanți ZIKV printr-un test MN50 și ZIKV Env și IgG specifice NS1 prin ELISA.

Pbmc-urile au fost colectate la momentul inițial, D7, D35, D90 și D164 pentru a evalua imunitatea mediată celular și răspunsurile celulelor B de memorie.

provocare cu ZIKV-PR de tip Sălbatic

la cinci luni după doza 2 (D176), macacii din grupele A, C, D și șase macaci naivi (grupa E: Control fals) au fost provocați cu 105 unități de formare a plăcii (PFU diluat în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS)) de wt-ZIKV-PR (tulpina PRVABC59 din CDC) prin injecție subcutanată (SC) în regiunea deltoidă a brațului drept și sub anestezie (zoletil XV) (fig. 1). Doza de provocare și Calea au fost selectate pe baza rezultatelor dintr-un studiu anterior (rezultate nepublicate).

prelevări biologice Post-provocare

Plasma a fost recoltată în fiecare zi timp de 7 zile și pe D9 și D15 post-provocare pentru teste virologice. LCR (100-300 unqql) a fost colectat de la cisterna magna pe D7, D15 și D28 post-provocare. Absența contaminării sângelui în LCR a fost confirmată prin inspecție vizuală, iar probele au fost depozitate la -80 C. Saliva a fost colectată în fiecare zi timp de 15 zile, iar fluidele oculare au fost colectate cu un tampon pe D7 și D15 post-provocare. Tampoanele au fost plasate în tuburi care conțin 500 unqtl de ARN mai târziu (Invitrogen, SUA) și au fost amestecate prin vortexare. Tampoanele au fost apoi aruncate, iar eluații au fost depozitați la -80 centi C până la analiză.

pentru testele imunologice, plasma a fost colectată în mai multe puncte de timp de la D15 la D112 și Pbmc au fost colectate pe D35 și D112.

Viremia și încărcăturile virale în fluidele biologice post-provocare

ARN-ul ZIKV în plasmă, salivă, lichid ocular și probe de LCR din grupele A, C, D și E au fost cuantificate post-provocare folosind un qRT-PCR care vizează gena NS522. ARN-ul genomic total a fost extras pentru prima dată din probe cu un kit de virus Macherey Nagel NucleoSpin 96 (Macherey Nagel, Germania) pe o stație de lucru automată de extracție a ARN Tecan Evoware conform instrucțiunilor producătorului și eluat în apă fără nuclează.

Sandwich Elisa pentru a cuantifica antigenul ZIKV NS1

conținutul rezidual de antigen ZIKV NS1 a fost cuantificat printr-un sandwich Elisa în preparatul de virus utilizat pentru provocare. De asemenea, a fost măsurată în nediluat și diluat (1:30) probele de plasmă colectate la momentul inițial, D1, D2, D3, D4 și D5 din toate grupurile contestate ca metodă indirectă de evaluare a replicării virale.

pe scurt, plăcile ELISA cu 96 de puțuri au fost acoperite cu un anticorp monoclonal de șoarece specific proteinei ZIKV NS1 (clona B-J5 r&D Biotech, Franța) în soluție salină tamponată cu fosfat 1 inkt (PBS). Siturile nelegate au fost apoi blocate timp de 1 oră la 37 centi C cu PBS-Tween20 în 1% lapte (PBS-Tw-M). Plăcile au fost spălate cu PBS-Tween20 între etapele de incubație. Probele de testare au fost diluate în serie de două ori în PBS-Tw-M și incubate în godeuri timp de 1 oră la 37 C. Un al doilea anticorp monoclonal de hrean peroxidază (HRP)-conjugat direcționat către proteina ZIKV NS1 (clona B-M6 r&D Biotech, Franța) a fost adăugat și incubat timp de 90 min la 37 C. apoi, plăcile au fost incubate în întuneric timp de 45 min la temperatura camerei (RT) cu un substrat gata de utilizare de TETRAMETILBENZIDINĂ (tebu-bio Laboratories, Franța). Reacțiile au fost oprite cu 1 n HCl (VWR Prolabo). Densitatea optică (OD) a fost măsurată la 450-650 nm cu un cititor automat de plăci. O proteină recombinantă ZIKV NS1 (antigen nativ, UK) a fost utilizată pentru a stabili o curbă standard pentru a determina conținutul de NS1 al probelor de testare. Concentrația proteică a fost determinată ca medie a tuturor concentrațiilor individuale pentru intervalul de valori OD de la 0,2 la 3,0. Limita de detecție (LOD) a testului a fost de 5 ng/mL.

testele imunologice

IgG specifice plicului și NS1

IgG specifice plicului și NS1 au fost evaluate prin ELISA pe plăci cu 96 de godeuri acoperite cu proteină e recombinantă (Meridian Life Science Inc., Memphis, SUA) sau proteină nestructurală recombinantă 1 (NS1) (Native Antigen Company, Oxford, Marea Britanie) în tampon carbonat, pH 9,6. În urma blocării cu PBS-Tween20-milk timp de 60 min la 37 sec.c, s-au adăugat probe de ser diluate de două ori și s-au incubat timp de 90 min la 37 sec. C. etapele de spălare au fost efectuate între etapele de incubare cu sec. Un IgG-conjugat HRP anti-Maimuță de capră (Ref aai42p, BIO-RAD, Franța) diluat în PBS-Tw-m la 1:5000 a fost adăugat și incubat timp de încă 90 min la 37 centimetric c înainte de dezvoltarea culorii cu substrat de tetrametilbenzidină (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, Franța). Densitatea optică a fost măsurată la 450-650 nm cu un cititor automat de plăci. Titrurile pentru IgG-uri specifice E au fost calculate utilizând o curbă de regresie serică de referință anti-ZIKV la maimuțe. Titrurile pentru IgG-uri specifice NS1 au fost calculate ca diluție reciprocă a serului, dând o densitate optică de 1 Folosind funcția de tendință. Titrul referinței a fost calculat anterior ca media mai multor determinări ale diluției reciproce, dând o densitate optică de 1,0. Toate titrurile au fost exprimate în unități Elisa log10 (UE). LOD a fost stabilit la 1,3 log10 EU și un titru arbitrar de 1,0 log10 a fost atribuit fiecărui titru sub LOD.

anticorpi neutralizanți ZIKV

un test ZIKV MN50 cu debit mare a fost utilizat pentru măsurarea anticorpilor neutralizanți specifici ZIKV22. Pe scurt, serurile inactivate termic au fost diluate în serie, amestecate cu ZIKV-PR și incubate la 37 centicc timp de 75 min. Amestecurile au fost apoi transferate pe plăci cu 96 de puțuri care conțin monostraturi de celule vero confluente. După incubare timp de 5 zile, celulele infectate au fost colorate cu pan-flavivirus biotinilat 4G2 mAb (HB112, Biotem, Franța) și vizualizate cu 5-bromo-4-Cloro-3-indolilfosfat/tetrazoliu albastru nitro în substrat de levamisol. Puțurile pozitive au fost definite ca cel puțin un focar infecțios colorat detectat. Pentru fiecare diluție s-a înregistrat numărul total de godeuri negative, iar diluția reciprocă corespunzătoare 50% din neutralizarea virală a fost calculată folosind metoda cel mai puțin pătrat și exprimată ca titru de neutralizare log10 MN50.

testul Imunospot (Elispot) legat de celulele B cu memorie

Pbmc-urile crio-conservate au fost decongelate rapid într-o baie de apă de 37 de centimetrii. Un amestec de ser de vițel fetal (FCS) / Dnază (100 de centicg/mL) a fost adăugat lent la Pbmc, înainte de a fi transferat la RPMIc (RPMI/10% FCS/glutamină/cocktail antibiotic). După 1 h la 37 C, Pbmc-urile au fost numărate folosind kitul Viacount Guava conform instrucțiunilor producătorului. Pbmc – urile au fost resuspendate la 1% 106 celule/mL în mediu de stimulare policlonală conținând RPMIc cu R848 (resiquimod) la 1%/ml și IL-2 la 10 ng/mL (ambele de la Mabtech) și incubate la 37% C cu 5% CO2 timp de 4 zile pentru a permite diferențierea celulelor B de memorie în celule secretoare de anticorpi (ASC)37.

plăcile Sterile 96-well multiscreen-IP cu membrane PVDF (Millipore) au fost pre-incubate cu 35 oktil de etanol 35%, apoi spălate de trei ori cu PBS 1x sterile înainte de a fi acoperite cu 100 oktil de anticorp uman anti-IgG (clona Mabtech 3850-3-1000) pentru a detecta celulele secretoare IgG totale sau particulele asemănătoare virusului (PRM / Env) (VLP) zikv sau NS1 ZIKV (compania nativă antigen, Marea Britanie). Plăcile au fost incubate peste noapte la 4 centimetric C și apoi spălate de trei ori cu 1x PBS sterile și saturate cu mediu RPMIc timp de 2 h la 37 centimetric C. Mediul RPMIc a fost apoi îndepărtat și Pbmc-urile au fost adăugate la 2500 și 5000 de celule în puțurile de captare acoperite cu anticorpi și la 200.000 și 400.000 de celule în puțurile acoperite cu zikv prM/Env VLP sau ZIKV NS1, în mediu RPMIc. Fiecare condiție a fost testată în trei exemplare, iar plăcile au fost incubate timp de 20 h la 37 CTC cu 5% CO2.

plăcile au fost spălate de două ori în PBS/Tween 20 (0,05%) și de trei ori cu PBS și incubate cu un IgG AB anti-uman biotinilat (clona MABTECH MT78/145-biotină, Suedia) la 1 hectolitru /mL în PBS 1 hectolitru / 0,5% BSA la RT timp de 1,5 ore. Plăcile au fost spălate în continuare de cinci ori în PBS și s-a adăugat streptavidină marcată cu ficoeritrină (Sigma, Franța) diluată 1:100 cu 0,5% PBS/BSA. Plăcile au fost incubate timp de 1 oră la RT, apoi spălate de șase ori cu PBS, uscate și păstrate în întuneric. Plăcile au fost citite cu cititorul Hlw20 (instrumentul Microvision) folosind software-ul IRIS și analizate cu Software Cosmic. Rezultatele sunt exprimate ca procent de ASCs specifice antigenului dintre ASCs totale IgG.

testele ELISpot cu celule T

răspunsurile imune specifice celulelor T ZIKV au fost evaluate prin teste Elispot IFNy și IL-5 folosind bazine de peptide 15-amino-acid (aa) cu 11 suprapuneri aa care acoperă proteinele Env, prM și capsida ZIKV (JPT, Germania). Pe scurt, plăcile 96-well multiscreen-IP cu membrane PVDF (Millipore) au fost pre-tratate cu etanol 35%, apoi acoperite peste noapte la 4 centimetric C cu 100 centimetric/well De IFNy anti-maimuță/uman (clona MABTECH MT126L) sau IL-5 anti-uman (clona MABTECH TRFK5) la 10 centimetric/mL în PBS steril 1 centimetric. După blocarea cu RPMIc (RPMI/10% FCS/glutamină/cocktail antibiotic), au fost incubate în trei exemplare 3 pbmc decongelate 105 cu 2 hectog/mL din fiecare peptidă ZIKV sau un bazin peptidic irelevant (control negativ) în prezența anti-CD28 (MAB CD28.2) și anti-CD49d (mAb 9F10) de la Biolegend ca co-stimulatori. Stimularea PHA (Remel) / PMA (SIGMA) a fost utilizată ca control pozitiv. După o incubare de 18 ore la 37 de centi c, plăcile au fost spălate în PBS-BSA 0.5% și incubat cu IFNy anti-uman biotinilat (clona mabtech 7-B6-1) sau il-5 anti-uman biotinilat (clona Mabtech 5A10) la 1 hectog/mL, sub 100 centicli/godeu, timp de 2 ore la RT, în întuneric. După spălare, plăcile au fost ulterior incubate cu streptavidin-PE (Southern Biotech) timp de 1 h la RT, în întuneric urmat de șase spălări în PBS-BSA 0,5%.

plăcile au fost citite cu cititorul HLW20 (instrumentul Microvision) folosind software-ul IRIS și analizate cu Software Cosmic. Rezultatele au fost exprimate ca numărul de celule formatoare de pete IFNy sau IL-5 (SFC) la 106 PBMCs.

metode statistice

toate datele au fost transformate în jurnal înainte de analizele statistice. De la D0 la D164, analizele răspunsurilor umorale au fost efectuate folosind un model longitudinal de analiză a varianțelor cu măsurători repetate la diferite puncte de timp pentru fiecare maimuță. Efectul de timp a fost modelat folosind un efect pătratic. Pentru a modela efectele provocării și impulsului, a fost utilizat un model longitudinal de analiză a varianței pentru fiecare citire. Pentru fiecare maimuță, în model au fost luate în considerare măsurători repetate la diferite puncte de timp. Ajustările Tukey sau Dunnett au fost efectuate pentru comparații multiple.

pentru imunitatea mediată celular, comparațiile între grupuri sau puncte de timp au fost făcute de un ANOVA unidirecțional sau folosind un model longitudinal în funcție de întrebarea biologică.

toate analizele au fost efectuate cu ajutorul software-ului SAS XV9.4 la un nivel alfa de 0,05. Valorile P mai mici decât această valoare au indicat diferențe semnificative statistic.

considerații etice

toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu Asociația pentru evaluarea și acreditarea instalațiilor de animale acreditate pentru îngrijirea animalelor de laborator, în conformitate cu Directiva Europeană 2010/63 și reglementările naționale franceze. Protocoalele au fost aprobate de Comitetul etic Sanofi Pasteur pentru experimentarea pe animale.

macacii care au fost utilizați în studiul challenge au fost eutanasiați uman la sfârșitul studiului (4 luni după provocare) din motive de biosecuritate, deoarece ZIKV a fost raportat a fi ocazional persistent în macaques30. Animalele utilizate pentru studiul de rapel au fost reutilizate în alte experimente de cercetare.

rezumat de raportare

informații suplimentare privind proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare privind cercetarea naturii legat de acest articol.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.