ett optimerat renat inaktiverat Zika-vaccin ger ihållande immunogenicitet och skydd i cynomolgus macaques

zPIV-och ZPIV-SP-vaccinformuleringar

zPIV-kandidaten (fas-i klinisk sats) tillhandahölls av WRAIR16. Vaccinet levererades i en flytande form, klar för injektion, vid 5 kg proteiner per dos (500 kg), motsvarande 200 antigena enheter (AU), formulerade med AlOOH. Det optimerade vaccinet (ZPIV-SP) bereddes vid Sanofi Pasteur (Marcy l ’ Etoile, Frankrike) med WRAIR-processen som utgångspunkt med följande förbättringar. Kort sagt, efter initial förstärkning av ZIKV-PR i Sanofi Pasteur Vero-celler, extraherades viralt RNA och transfekterades till Sanofi Pasteurs serumfria (SPSF) Vero-celler. Återvunnet virus förstärktes, plackrenades två gånger och förstärktes ytterligare för att generera ett pre-Master Fröparti från vilket en mästare och ett fungerande Fröparti härleddes. Viruset producerades i en 180 L bioreaktor med SPSF Vero-celler. Viruset klargjordes sedan, renades genom ultracentrifugering med en modifierad cutoff och kromatografi och inaktiverades genom formalinbehandling. Parametrarna för renings-och inaktiveringsstegen optimerades jämfört med de förhållanden som användes av WRAIR. Läkemedelsprodukten justerades för ZIKV-kuvert (E) antigeninnehåll med ELISA till 400 AU/mL (motsvarande 10 kg/mL ZPIV-proteiner) och lyofiliserades. Det lyofiliserade vaccinet justerades till 100, 200 eller 400 AU per dos (500 oc) och resuspenderades i en AlOOH gel (500 oc/dos—Brenntag Biosector, Danmark). AU definierades som envelope (env) antigeninnehåll mätt med ELISA.

vaccinationsschema

fyra grupper av sex flavivirus-negativa manliga cynomolgus macaques (Macaca fascicularis – Noveprim), i åldern 2 år, fick 500 okyl av första generationens ZPIV (grupp A: 200 AU) eller optimerad ZPIV-SP (grupp B: 100 AU, Grupp C: 200 AU eller grupp D: 400 AU) intramuskulärt (IM) i rätt quadriceps på dag 0 (D0) och i vänster quadriceps på D28. Sex månader senare (D176) fick de sex makakerna i Grupp B som hade fått 100 AU ZPIV-SP, en boosterdos av samma formulering och följdes i 6 månader (Fig. 1). De andra grupperna användes för den virala utmaningen.

klinisk övervakning

omedelbara reaktioner observerades inom 30 minuter och potentiella lokala reaktioner på injektionsstället observerades under de 7 dagarna efter varje immunisering. Makakerna övervakades varje dag och symtom som minskat matintag, begränsad rörlighet, polypnea, lokala och systemiska reaktioner registrerades under hela studien. Kroppsvikt och kroppstemperatur (med användning av transponderchips) registrerades vid baslinjen och med jämna mellanrum under hela studien.

blodprovtagning efter immunisering för immunogenicitetsbedömning

Sera samlades vid olika tidpunkter under 6 månader efter dos 1 och 2 (D0 till D164) och efter boost för grupp B (D15 till D170) för att bedöma humorala svar, inklusive ZIKV-neutraliserande antikroppar med en mn50-analys och ZIKV env och NS1-specifikt IgG med ELISA.

Pbmc samlades in vid baslinjen, D7, D35, D90 och D164 för att bedöma cellmedierad immunitet och minne B-cellsvar.

utmaning med vildtyp ZIKV-PR

fem månader efter dos 2 (D176) utmanades makakerna i grupperna A, C, D och sex naiva makaker (grupp E: sham control) med 105 plackbildande enheter (PFU utspädd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) av wt-ZIKV-PR (stam PRVABC59 från CDC) genom subkutan (SC) injektion i deltoidområdet i höger arm och under narkos (zoletil 2) (Fig. 1). Utmaningsdosen och vägen valdes baserat på resultat från en tidigare studie (opublicerade resultat).

biologiska provtagningar efter utmaning

Plasma samlades in varje dag i 7 dagar och på d9 och D15 efter utmaning för virologiska analyser. CSF (100-300 Baccarat) samlades in från cisterna magna på D7, D15 och D28 efter utmaningen. Frånvaro av blodkontaminering i CSF bekräftades genom visuell inspektion och prover lagrades vid -80 kcal C. Saliv samlades varje dag i 15 dagar och okulära vätskor samlades in med en vattpinne på D7 och D15 efter utmaning. Svabbarna placerades i rör innehållande 500 oc RNA senare (Invitrogen, USA) och blandades genom vortexing. Vattpinnarna kastades sedan bort och eluater lagrades vid -80 2BG C tills de analyserades.

för immunologiska analyser samlades plasma vid flera tidpunkter från D15 till D112 och Pbmc samlades på D35 och D112.

viremi och virusbelastningar i biologiska vätskor efter utmaning

ZIKV RNA i plasma -, saliv -, okulärvätska-och CSF-prover från grupperna A, C, D och E kvantifierades efter utmaning med användning av en qRT-PCR riktad mot NS5-genen 22. Totalt genomiskt RNA extraherades först från prover med en Macherey Nagel NucleoSpin 96 virussats (Macherey Nagel, Tyskland) på en Tecan evoware automatiserad RNA-extraktionsstation enligt tillverkarens instruktioner och eluerades i nukleasfritt vatten.

Sandwich ELISA för att kvantifiera ZIKV NS1-antigen

kvarvarande ZIKV NS1-antigeninnehåll kvantifierades med en sandwich ELISA i virusberedningen som användes för utmaning. Det mättes också i outspädd och utspädd (1:30) plasmaprover som samlats in vid baslinjen, D1, D2, D3, D4 och D5 från alla utmanade grupper som en indirekt metod för att bedöma viral replikation.

kort sagt, 96-brunns ELISA-plattor belades med en monoklonal antikropp som är specifik för ZIKV NS1-proteinet (klon B-J5 r&d Biotech, Frankrike) i fosfatbuffrad saltlösning 1 kg (PBS). Obundna platser blockerades sedan för 1 h vid 37 CCB med PBS-Tween20 i 1% mjölk (PBS-Tw-M). Plattorna tvättades med PBS-Tween20 mellan inkubationssteg. Testprover späddes seriellt tvåfaldigt i PBS-Tw-M och inkuberades i brunnarna i 1 h vid 37 kg C. En andra monoklonal antikropp pepparrot peroxidas (HRP)-konjugat riktat till ZIKV ns1-protein (klon B-M6 r&d Biotech, Frankrike) tillsattes och inkuberades i 90 minuter vid 37 kg C. sedan inkuberades plattorna i mörkret i 45 minuter vid rumstemperatur (rt) med ett färdigt TETRAMETYLBENSIDIN (tebu-bio Laboratories, Frankrike) substrat. Reaktionerna stoppades med 1 N HCl (VWR Prolabo). Den optiska densiteten (OD) mättes vid 450-650 nm med en automatisk plattläsare. Ett ZIKV NS1 rekombinant protein (nativt Antigen, UK) användes för att fastställa en standardkurva för att bestämma ns1-innehållet i testproverna. Proteinkoncentrationen bestämdes som medelvärdet av alla individuella koncentrationer för OD-värdeområdet 0,2 till 3,0. Detektionsgränsen (LOD) för analysen var 5 ng/mL.

immunologiska analyser

kuvert-och NS1-specifika IgGs

kuvert – och NS1-specifika IgGs bedömdes med ELISA i 96-brunnsplattor belagda med rekombinant E-protein (Meridian Life Science Inc., Memphis, USA) eller rekombinant icke-strukturellt protein 1 (NS1) protein (Native Antigen Company, Oxford, Storbritannien) i karbonatbuffert, pH 9.6. Efter blockering med PBS-Tween20-mjölk för 60 min vid 37 CCB, tillsattes tvåfaldiga utspädda serumprover och inkuberades för 90 min vid 37 CCB.tvättsteg utfördes mellan inkubationssteg med PBS-Tween. En get anti-apa IGG HRP-konjugat (Ref AAI42P, BIO-RAD, Frankrike) utspätt i PBS-Tw-M vid 1:5000 tillsattes och inkuberades i ytterligare 90 min vid 37 kg C före färgutveckling med tetrametylbenzidinsubstrat (Tebu-Bio Laboratories, Le-Perray-en-Yvelines, Frankrike). Optisk densitet mättes vid 450-650 nm med en automatisk plattläsare. Titrar för E-specifika IgGs beräknades med användning av en anti-ZIKV apa referensserumregressionskurva. Titrar för NS1-specifika IgGs beräknades som den ömsesidiga utspädningen av serumet vilket gav en optisk densitet av 1 med användning av tendensfunktionen. Referenstitern beräknades tidigare som medelvärdet av flera bestämningar av den ömsesidiga utspädningen vilket ger en optisk densitet på 1,0. Alla titrar uttrycktes i log10 ELISA-enheter (EU). LOD sattes till 1.3 log10 EU och en godtycklig titer av 1.0 log10 tilldelades varje titer under LOD.

ZIKV-neutraliserande antikroppar

en ZIKV mn50-analys med hög genomströmning användes för mätning av ZIKV-specifika neutraliserande antikroppar22. Kort sagt, värmeinaktiverades sera späddes seriellt, blandades med ZIKV-PR och inkuberades vid 37 kcal C i 75 minuter. Blandningarna överfördes sedan till 96-brunnsplattor innehållande sammanflytande Vero-cellmonolager. Efter inkubation i 5 dagar färgades infekterade celler med biotinylerat pan-flavivirus 4G2 mAb (HB112, Biotem, Frankrike) och visualiserades med 5-bromo-4-kloro-3-indolylfosfat/nitroblått tetrazolium i Levamisolsubstrat. Positiva brunnar definierades som minst ett färgat infektiöst fokus detekterat. För varje utspädning registrerades det totala antalet negativa brunnar och den ömsesidiga utspädningen motsvarande 50% av viral neutralisering beräknades med användning av minsta kvadratmetoden och uttrycktes som neutraliseringsloggen 10 MN50 titer.

Memory B-cell enzyme-linked immunospot (ELISpot) analys

Cryo-konserverade Pbmc tinades snabbt i ett 37 C-vattenbad. En blandning av fetalt kalvserum (FCS) / DNAse (100 kg/mL) tillsattes långsamt till Pbmc, innan den överfördes till RPMIc (RPMI/10% FCS/glutamin/antibiotisk cocktail). Efter 1 h vid 37 c c räknades Pbmc med Viacount Guava kit enligt tillverkarens instruktioner. Pbmc: erna omsuspenderades vid 1-106-celler/mL i polyklonalt stimuleringsmedium innehållande RPMIc med r848 (resiquimod) vid 1 oc/mL och IL-2 vid 10 ng/mL (båda från Mabtech) och inkuberades vid 37 oc C med 5% CO2 i 4 dagar för att möjliggöra differentiering av minne B-celler i antikroppssekreterande celler (ASC)37.

sterila 96-brunns Multiscreen-IP-plattor med PVDF-membran (Millipore) förinkuberades med 35 kg 35% etanol och tvättades sedan tre gånger med steril PBS 1X innan de belades med 100 kg av en anti-IGG-human antikropp (mabtech-klon 3850-3-1000) för att detektera totala IGG-utsöndrande celler eller pre-membran och kuvert (prM / Env) virusliknande partiklar (VLP) ZIKV eller NS1 ZIKV (native antigen company, Storbritannien). Plattorna inkuberades över natten vid 4 kg C och tvättades sedan tre gånger med sterila 1x PBS och mättades med RPMIc medium för 2 timmar vid 37 kg C. Rpmiskt medium avlägsnades sedan och Pbmc tillsattes vid 2500 och 5000 celler i antikroppsbelagda infångningsbrunnar och vid 200 000 och 400 000 celler i ZIKV prM/env VLP eller ZIKV NS1-belagda brunnar, i Rpmiskt medium. Varje tillstånd testades i tre exemplar och plattor inkuberades för 20 h vid 37 c-c med 5% CO2.

plattorna tvättades två gånger i PBS / Tween 20 (0,05%) och tre gånger med PBS och inkuberades med en biotinylerad anti-human IgG Ab (Mabtech clone MT78/145-Biotin, Sverige) vid 1 kg/ml i PBS 1 kg /0,5% BSA vid RT under 1,5 timmar. Plattorna tvättades ytterligare fem gånger i PBS och phycoerythrin-märkt streptavidin (Sigma, Frankrike) utspätt 1:100 med 0,5% PBS/BSA tillsattes. Plattorna inkuberades i 1 h vid RT, tvättades sedan sex gånger med PBS, torkades och hölls i mörkret. Plattorna lästes med hlw20-läsaren (Microvision Instrument) med IRIS-programvara och analyserades med kosmisk programvara. Resultaten uttrycks som procentandelen antigenspecifika ASCs bland totala IGG ASCs.

T-cell ELISpot-analyser

ZIKV-specifika t-cellsimmunsvar bedömdes med IFNy-och IL-5 ELISpot-analyser med användning av pooler av 15-aminosyra (aa) peptider med 11 aa-överlappningar som täcker Env -, prM-och kapsid ZIKV-proteinerna (JPT, Tyskland). I korthet behandlades 96-brunns Multiscreen-IP-plattor med PVDF-membran (Millipore) med 35% etanol och belades sedan över natten vid 4 kg C med 100 kg/brunn av anti-monkey/human IFNy (Mabtech clone MT126L) eller anti-human IL-5 (Mabtech clone TRFK5) vid 10 kg/mL i steril PBS 1 kg. Efter blockering med RPMIc (RPMI/10% FCS/glutamin/antibiotisk cocktail) inkuberades 3 105-upptinade PBMCs i tre exemplar med 2 kg/mL av varje ZIKV-peptider eller en irrelevant peptidpool (negativ kontroll) i närvaro av anti-CD28 (mAb CD28.2) och anti-CD49d (mAb 9f10) från Biolegend som samstimulatorer. Pha (Remel)/PMA (SIGMA) stimulering användes som positiv kontroll. Efter en 18-timmars inkubation vid 37 ccbv tvättades plattorna i PBS-BSA 0.5% och inkuberas med biotinylerad anti-human IFNy (Mabtech-klon 7-B6-1) eller biotinylerad anti-human IL-5 (Mabtech-klon 5A10) vid 1 kg/mL, under 100 kg/brunn, för 2 h vid RT, i mörkret. Efter tvättning inkuberades plattorna därefter med streptavidin-PE (Southern Biotech) i 1 h vid RT, i mörkret följt av sex tvättar i PBS-BSA 0,5%.

plattorna lästes med hlw20-läsaren (Microvision Instrument) med IRIS-programvara och analyserades med kosmisk programvara. Resultaten uttrycktes som antalet IFNy-eller IL-5-spotbildande celler (SFC) per 106 Pbmc.

statistiska metoder

Alla data loggtransformerades före statistiska analyser. Från D0 till D164 utfördes analyserna av de humorala svaren med användning av en longitudinell modell för analys av varianser med upprepade mätningar vid olika tidpunkter för varje apa. Tidseffekten modellerades med en kvadratisk effekt. För att modellera utmaningen och boosteffekterna användes en longitudinell modell för variansanalys för varje avläsning. För varje apa beaktades upprepade mätningar vid olika tidpunkter i modellen. Tukey-eller Dunnett-justeringar utfördes för flera jämförelser.

för cellmedierad immunitet gjordes jämförelser mellan grupper eller tidpunkter av en enkelriktad ANOVA eller med användning av en longitudinell modell beroende på den biologiska frågan.

alla analyser utfördes med hjälp av SAS Macau V9.4-programvara på en alfa-nivå av 0.05. P-värden lägre än detta värde indikerade statistiskt signifikanta skillnader.

etiska överväganden

alla djurförsök utfördes i enlighet med Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited animal facilities, i enlighet med det europeiska direktivet 2010/63 och franska nationella bestämmelser. Protokollen godkändes av Sanofi Pasteur Ethical Committee för djurförsök.

de makaker som användes i challenge-studien avlivades humant i slutet av studien (4 månader efter utmaningen) av biosäkerhetsskäl, eftersom ZIKV har rapporterats vara ibland ihållande i macaques30. Djur som användes för boosterstudien återanvändes i andra forskningsexperiment.

rapportsammanfattning

Mer information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till denna artikel.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.