Keystone Virus isolerat från en Florida tonåring med utslag och subjektiv feber: ett annat endemiskt Arbovirus i sydöstra USA?

Abstrakt

Keystone virus, en Kalifornien-serogrupp orthobunyavirus, isolerades först 1964 från myggor i Keystone, Florida. Det fanns inga tidigare rapporter om isolering från människor, trots studier som tyder på att ~20% av personerna som bor i regionen är seropositiva. Vi rapporterar virusisolering från en tonåring i Florida med utslag och feber.

uppkomsten av Zika-viruset (ZIKV) och pågående identifiering av Chikungunya-virus och denguevirusinfektioner har genererat ökande oro över endemicitet och spridning av arbovirus i USA. Keystone virus (KEYV; släktet Orthobunyavirus, familjen Peribunyaviridae), en medlem av orthobunyavirus Kalifornien serogrupp, isolerades först från myggor i Keystone, Florida (nära Tampa Bay), 1964 . Efterföljande studier visade utbredd distribution av viruset i myggor, särskilt Aedes atlanticus, liksom i ekorrar, tvättbjörnar och Whitetail rådjur, i kustregioner som sträcker sig från Chesapeake Bay söderut genom Florida och så långt västerut som Texas .

i studier utförda på humana populationer på 1960-talet var seropositivitetsgraden i intervallet 19-21% . Faktisk isolering av KEYV från människor har emellertid aldrig tidigare rapporterats, och KEYV har inte heller kopplats till ett kliniskt syndrom hos människor, trots dess uppenbara endemicitet hos djur och myggor.

fallrapport

en 16-årig tidigare frisk man som presenterades i augusti 2016 till en akutvårdsklinik i nord-centrala Florida med en historia av lågkvalitativ feber och diffus hudutslag. Patienten rapporterade att han kände sig ”varm” kvällen innan, med en temperatur som uppskattades av sina föräldrar att ligga i intervallet ~100 kcal F. Ett erytematöst papulärt utslag uppträdde på morgonen av presentationen, började på bröstet och spred sig gradvis till buken, armen, ryggen och ansiktet. Det fanns inga blåsor, och utslaget var smärtfritt och icke-pruritiskt. Det förvärrades av värme och solljus. Patienten nekade frossa, huvudvärk, nackstivhet eller gastrointestinala symtom. Han noterade mild trötthet och obehag i fotleden, vilket han tillskrev samtidig närvaro vid ett sommarläger för marschbandsdeltagare, bär nya bandskor. Föregående vecka hade patienten diagnostiserats med möjlig tonsillit och hade placerats på behandling med amoxicillin vid 500 mg oralt 3 gånger om dagen, vilket han själv hade avbrutit dagen efter. Han hade ingen relevant tidigare medicinsk eller kirurgisk historia; Inga kända immunsuppressiva eller medfödda tillstånd; inga kända allergier; ingen ny resa utanför centrala Florida; och ingen exponering för gårdar eller husdjur. Han hade fått alla rekommenderade barnvaccinationer. Inga andra familjemedlemmar var sjuka. Patienten och hans familj hade flyttat till Florida Från Kansas (där Keystone virus inte har identifierats) 4 år före den rapporterade sjukdomen. Bandlägret som han deltog fortsatte in på kvällen, och han rapporterade att han blev biten flera gånger av myggor, trots appliceringen av dietyltoluamid (allmänt känd som DEET).

vid undersökning på kliniken hade han en temperatur på 98,5 f (36,9 C), puls på 69 slag / minut, andningsfrekvens på 12 andetag/minut och blodtryck på 122/82 mm/Hg. En diffus, erytematös, papulär utslag av stammen, armen och ansiktet noterades (Figur 1). Patientens huvud -, nacke -, andnings -, hjärt-och bukundersökningar var normala. Ett snabbt Monospot-test som utfördes på kliniken var negativt. Med patientens och hans föräldrars samtycke samlades saliv-och urinprover. Utslaget försvann 2 dagar senare, utan ytterligare feber. Han har därefter tagit amoxicillin utan utslag av utslag.

VIRAL IDENTIFICATION / ISOLATION

Reverse transkription polymeras Chain Reaction Screens

eftersom patienten uppvisade en historia av utslag och feber under en period då ett ZIKV-utbrott inträffade i Florida testades saliv-och urinprover och var negativa för ZIKV, Chikungunya-virus och denguevirus serotyp 1-4 genomisk ribonukleinsyra (RNA) genom omvänd transkription polymeraskedjereaktion (RT-PCR) . Möjligheten till en alfavirus-eller flavivirus-etiologi utvärderades ytterligare genom att utföra RT-PCR med användning av universella primers som detekterar alfavirus och flavivirus i Brasilien . Både saliv-och urinprover testades negativt för alfavirus och flavivirus vRNAs, medan positiva kontroller fungerade som förväntat (data visas inte).

objektiv omvänd Transkriptionspolymeraskedjereaktion och sekvensering för identifiering av förmodat viralt etiologiskt medel

en presumtiv virusidentitet erhölls efter en modifiering av ett förfarande som vi tidigare skisserat ; detaljerade metoder finns i de kompletterande uppgifter som åtföljer detta dokument. Viralt genomiskt RNA (och/eller deoxiribonukleinsyra ) extraherades från virioner med användning av en QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen Inc.). PCR-amplikoner renades (Qiagen QIAquick PCR-reningssats) och A-tailed med Taq DNA-polymeras (New England Biolabs). De a-tailed PCR-amplikonerna TA-klonades sedan och insatserna sekvenserades med användning av Sanger-sekvensering. Av totalt 40 plasmider med TA-klonade insatser (20 insatser från urin, 20 från saliv) innehöll 1 från urin en 166-bp-insats med en 99% identitet av Keystone virus smågenomsekvenser deponerade med GenBank (KT630293.1, U12801.1 och KT630290.1).

direkt sekvensering av Keystone-Virus i urinen

eftersom det finns många ortobunyavirus och publicerade RT-PCR-primers för sekvensering av KEYV inte var tillgängliga, sekvenserades viruset med hjälp av specialdesignade primers baserade på 3 tillgängliga, kompletta Keystone-virusgenom i GenBank. Sekvensering åstadkoms med hjälp av en genomvandringsstrategi, med PCR-primrarna beskrivna i kompletterande Tabell 1; våra kompletta metoder ingår i tilläggsdata. Sekvensen betecknades som KEYV/Homo sapiens / Gainesville-1/2016; de 3 genomsegmentsekvenserna har deponerats i GenBank under anslutningsnumren MH016784 (stort segment), MH016785 (medelsegment) och MH016786 (litet segment). Den kompletta L – genomsekvensen har 98 till 99% identiteter med motsvarande genom av de enda 3 andra kompletta Keystone virus L-sekvenserna tillgängliga i Genbank (KT630288.1, KX817321.1 och KT630291.1). På samma sätt har det fullständiga M-genomet 98 till 99% gemensamt med motsvarande M-sekvenser (AF123489.1, KT630289.1 och KX817322.1) och 99% gemensamt med motsvarande s-genomsekvenser (KT630293.1, U12801.1 och KT630290.1).

isolering och visualisering av Keystone Virus i odlade celler

eftersom Keystone virus vRNA detekterades genom opartisk sekvensering( och senare var helt sekvenserad), försök gjordes för att isolera viruset i en cellinje känd för att stödja dess tillväxt (Vero-celler) och i mus neuroblastom cellinje Neuro-2a; en beskrivning av de fullständiga metoderna finns i tilläggsdata. Virusinducerade blandade cytopatiska effekter (CPE) var uppenbara i Neuro-2a-celler 2 dagar efter inokulering av cellerna med urin, men inte med saliv, och detsamma observerades 1 dag senare i Vero E6-celler. Vid subkultur var CPE uppenbara 2 dagar efter inokulering av Vero E6-celler med använt media från urininokulerade Neuro-2a. KEYV-inducerad CPE bildad i Vero E6-celler avbildas i kompletterande figurer S1A och S1B; både ursprungliga urininokulerade Vero E6-och Vero E6-celler inokulerade med virusinfekterade Neuro-2a-celler bildade samma typ av CPE. Supernatanter av de virusinfekterade cellerna var positiva för KEYV vRNA med RT-PCR, medan de från mock-inokulerade kontroller var negativa för KEYV vRNA.

för att demonstrera aktiv Keystone-virusreplikation analyserades Vero E6-celler som visade signifikant CPE (>70% av det infekterade cellmonoskiktet) 40 timmar efter infektion med transmissionselektronmikroskopi och visades visa typisk bunyavirusinducerad CPE och produktion av avkomman virioner. Metoder och bilder (kompletterande siffror S2A–F) ingår i tilläggsdata.

kommentar

KEYV, en negativ känsla enkelsträngat RNA-virus, är i allmänhet placeras i vad som har kallats ”California serogrupp” av släktet Orthobunyavirus, som inkluderar, bland andra, California encefalit virus, Jamestown Canyon virus, och La Crosse encefalit virus. KEYV, baserat på studier som genomfördes på 1960-och 1970-talet, verkar vara utbredd i kustområden i sydöstra USA, med isolat identifierade (i mygg-och djurprover) från Chesapeake Bay till Texas. Organismen verkar ha ett antal ryggradsvärdar, inklusive, som tidigare nämnts, grå ekorre (30% seropositivitet i en studie i Pokomoke Cypress Swamp i Maryland ), tvättbjörnar (18% seropositiv i samma studie) och vitstjärtad hjort (10% seropositiv i Maryland-studien; 2% seropositiv i en studie i Texas ); det verkar vara sällsynt i fågel-eller reptilpopulationer. Viruset kan överföras transovariellt i myggor, med A. atlanticus som verkar vara en primär vektor (även om KEYV har identifierats i andra Aedes-och Culex-arter ). Bilden som framträder är den av ett virus som är endemiskt mot myggor och ryggradsdjur i skogen, om än av osäker klinisk betydelse i djurpopulationer.

det är då frågan om KEYV: s relevans för människor. Seroprevalensstudier som genomfördes för 50 år sedan med hjälp av virala neutraliseringsanalyser föreslog att seropositivitet hos friska humana populationer var i intervallet 20% . Våra data visade att mänskliga infektioner kan (och fortfarande gör) inträffa, med livskraftigt virus som kan detekteras i urinen. Även om vi inte kan säga definitivt att viruset var ansvarig för utslag och rapporterade feber, våra data är tydligt suggestiva, och höja möjligheten att en del av vad som annars utmärker utslag och feber fall ses i primärvårdsinställningar i kustområden i sydöstra USA faktiskt återspeglar KEYV infektioner. Många av virusen i Kalifornien-gruppen har kopplats till encefalit och, som demonstreras i denna rapport, växer viruset bra i neuroblastomcellinjer; i fall av viral encefalit där ingen etiologi bestäms kan det också vara värt att leta efter KEYV-infektioner. I det aktuella fallet, vid oro för en ZIKV-infektion, resulterade en omfattande virologisk utvärdering i isolering av viruset; det är högst osannolikt att det, utanför en liknande forskningsinställning, någonsin skulle ha identifierats. Våra resultat understryker mångfalden av potentiella arbovirala patogener i denna region och föreslår att en omfattande analys av möjliga virala patogener bör inkludera diagnostik för KEYV.

kompletterande Data

kompletterande material finns tillgängliga på Kliniska infektionssjukdomar online. Består av data som tillhandahålls av författarna för att gynna läsaren, är det upplagda materialet inte kopierat och är ensam ansvar för författarna, så frågor eller kommentarer bör riktas till motsvarande författare.

anteckningar

ekonomiskt stöd. Detta arbete stöddes av intern finansiering från University of Florida Emerging Pathogens Institute och Institutionen för miljö och Global hälsa, College of Public Health and Health Professions.

potentiella intressekonflikter. Alla författare: inga rapporterade intressekonflikter. Alla författare har lämnat in ICMJE-formuläret för utlämnande av potentiella intressekonflikter. Konflikter som redaktörerna anser vara relevanta för innehållet i manuskriptet har avslöjats.